大肠杆菌培养基的优化及发酵罐操作

大肠杆菌高密度发酵第二组小组长：李青小组成员：韩娇月、李洋、冯春红、胡建贝、倪娜娜、常亚培、许志扬、李瑞兵、郭荣欣目录大肠杆菌高密度发酵培养基选择培养基配置培养方式培养条件操作流程具体步骤参数控制注意事项大肠杆菌大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌,许多有价值的多肽和蛋白在大肠杆菌中已成功地进行了表达,表达水平有些高达细胞总蛋白的30%以上.大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,由于具有遗传背景清楚,目的基因表达水平高,技术操作、培养条件简单,抗污染能力强,大规模发酵经济等优点,倍受遗传工程专家重视,是目前应用最广泛,最成功的表达体系.高密度培养技术高密度培养技术：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组建的基因工程菌的表达产物,大肠杆菌的生物量,表达产物在菌体内和发酵液中的浓度比较低,难以获得理想的生产效率和经济效益。应用高密度发酵不但可获得较高的生物量,而且可显著提高目的基因表达产物的浓度。高密度发酵对发酵设备有较高的要求,而且对发酵条件也有非常高的要求。影响高密度发酵的因素非常多,如细菌生长所需的营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓度、培养温度、发酵液的pH值、补料方式及发酵液流变学特性等。大肠杆菌高密度培养最关键的问题是代谢副产物乙酸积累所引起的抑制和毒害作用。预防措施：1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生：比生长速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率。2、透析培养：在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。3、控制葡萄糖的浓度：葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上，以减少乙酸的产生。培养基选择LB培养基(种子培养基):胰蛋白胨5g,酵母粉2.5g,NaCl5g,溶于500mlH2O,NaOH调节pH7.0,2L三角瓶装,灭菌锅湿热高压灭菌121℃,20min,室温保存.TB培养基(发酵培养基):胰蛋白胨240g,酵母粉480g,甘油80g,消泡剂1ml,溶于H2O,定容至19L,B.Braun发酵罐在位灭菌121℃,15min.培养基配制配制种子固体培养基100mL，分装试管，0.1MPa灭菌20min，然后摆成斜面。配制种子培养液600mL，分装50mL于一个250mL三角瓶中（作一级种子瓶），余下550mL平均分装于三个500mL三角瓶中（作二级种子用），同上灭菌。培养方式微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批3种。大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养，这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。培养基营养成分过高会抑制细胞的生长，采用流加补料是提高细胞浓度和外源蛋白产量的有效方式，高密度培养通过调节限制性底物的流加速率来调控细胞生长。培养条件1、温度：36~38℃2、pH：73、搅拌速率：100~200r/min4、溶氧:20~50%5、通风：2~3L/min6、接种量：1~2%操作步骤1、菌种准备2、上罐前的准备及实罐灭菌3、发酵操作4、发酵管理5、发酵过程中各生化指标的测定6、补料7、放罐8、清洗菌种准备1、上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37℃培养24h。2、上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，37℃振荡培养12h，然后转接二级种子瓶，37℃振荡培养10h。上罐前的准备及实罐灭菌1、洗净发酵罐及各联接胶管2、配制发酵培养基5.0L，置发酵罐内，加入几滴泡敌。3、校正pH电极和溶氧（DO）电极。4、把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套出、进水阀V2、W1，使夹套充满水，用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min，开启冷凝水出水阀V1，开启蒸气阀门S1，进行在位灭菌。发酵罐上罐前的准备及实罐灭菌5、当保护罩顶部阀门V4有蒸气排出时，2min后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时，微开阀V4适当排气，并调整蒸气阀S1维持罐温。保温结束后，关蒸气阀S1，全开冷凝水出水阀V1，开进水阀W3，将温度设定在37℃，切入自动。6、当温度降到100℃以下，缓缓开排气阀V4，使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。上罐前的准备及实罐灭菌7、连接通气管路，将进气过滤器K7口与控制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通空气压缩机电源，对发酵罐进行通气，调整空气流量3～5L/min。8、当温度达到37℃时，将预先灭菌的pH电极、DO电极（75%酒精消毒、UV消毒）接入发酵罐，连接各电极导线。上罐前的准备及实罐灭菌9、将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液体，将输出上限设在15%，下限设为“0”，待一切准备就绪，将“手动”开关调节到“自动”状态。10、设定搅拌转速为300r/min、空气流量2～3L/min、pH7.0、DO100%，系统进入发酵状态。发酵操作􀂄当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，进行如下操作：1、取样：松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶，开J2、J3排出取样管内残料，夹紧J2、J32、接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种后立即进行第一次取样，用于测定细菌OD值。发酵管理控制发酵过程的各项参数（温度、PH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等），如参数出现异常现象，则应及时排除。每小时取一次样，每次取样50ml。取样时先将空气流量计旋钮调至0~1L/min，松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入量筒，当达到40mL，开J2排出取样管内残料，夹紧J3、J2。将样液入标记有取样时间的三角瓶，用保鲜膜封口，立即入冰箱冷藏，取完样要及时清洗量筒。每次取样前（每隔1小时）记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测定数值，并记录操作情况。发酵过程中各生化指标的测定发酵过程中，虽然能自动控制温度和pH两个重要条件，但仍需专人负责照看。完成下列工作：（1）经常注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。（2）每小时取样测定细菌光密度值，进行革兰氏染色及镜检，以了解菌生长情况及检查是否有杂菌污染。（3）随着培养时间的延长，适当地调节进气量和搅拌转速，以维持一定的DO值。发酵过程中各生化指标的测定（4）定时取样用裴林快速定糖法测定培养液中还原糖的含量。测定步骤如下：①发酵液中糖含量小于4％时，直接取发酵液0.5ml于锥形瓶中，若糖含量大于4％时，先稀释10倍后，取稀释液0.5ml于锥形瓶中。②向锥形瓶加入裴林试剂甲液和乙液各5ml，混匀，加热至沸腾。③用0.1％标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，记录消耗葡萄糖液的体积数（V）。④取0.5ml蒸馏水于锥形瓶中，同法进行滴定，记录消耗葡萄糖的体积数（V0）。⑤按下公式进行计算：(V0-V)x0.1/0.5x稀释倍数V0为葡萄糖滴定空白时消耗的毫升数。V为葡萄糖滴定样品时消耗的毫升数。发酵过程中各生化指标的测定（5）定时取样测定发酵液中氨基氮的含量，测定步骤如下：①取发酵液经3500r／min离心10min。②分别吸取上清液2.0ml于两个磨口具塞锥形瓶中，各加蒸馏水5ml。向另一磨口具塞锥形瓶中加入7ml蒸馏水，作空白对照。③向上述3个瓶各加中性申醛溶液5.0ml，混匀，加0.5％溴麝香草酚兰液2滴和0.5％酚酞液4滴。④用标准0.100mol／LNaOH溶液滴定至紫色，分别记录消耗的NaOH液毫升数。⑤按下式计算:(V0-V)x1.4008V为滴定发酵液时消耗NaOH溶液的毫升数。V0为滴定空白时消耗NaOH溶液的毫升数。1.4008为1ml0.1mol／LNaOH溶液相当的氮毫克数，氨基氮的含量是每毫升中的含量。发酵过程中各生化指标的测定（6）测定OD值⑴大肠杆菌标准曲线的绘制：取10mL离心管，与105℃烘2h至恒重，用镊子夹取入干燥器，待冷却后于分析天平上称重（W0），精确到小数后4位，然后准确取10mL发酵液，于3000rpm离心10min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀，同上离心，弃上清液，与100℃烘至恒重，用镊子夹取如干燥器中冷却，于分析天平上称重（W1），精确至小数后4位，得细胞干重为W1-W0。取同一发酵液，稀释2、5、10、20、50倍，于600nm下测OD值。以0D值为纵坐标，菌液浓度（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。⑵均匀取样品5mL于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在721分光光度计上测定A600，根据菌体浓度与吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。⑶其余发酵液于3℃，2000r/min条件下离心分离8min,上清液装入编号三角瓶，用于测糖。发酵过程中各生化指标的测定（7）当发酵到一定时候，光密度值达到1～1.5，发酵液中还原糖和氨基氮含量较低时，开始补料，并在发酵结束前一小时终止。（8）每小时记录发酵过程温度、pH和DO的测定数值，并记录操作情况。大肠杆菌流加发酵策略大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株，广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生，因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5g/L，大肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于饥饿状态。补料方式采用简单反馈控制补料，又称单一循环法，此法控制与营养物利用相偶联的pH或溶解氧浓度等参数,使之保持恒定。例如,预先设定pH恒定值,发酵中菌体代谢产生酸性物质或铵,使pH值发生改变,从而启动控制开关,开始补料,pH恢复至恒定值以溶解氧浓度作为补料开关则是根据培养基中某种关键营养物(主要是碳源)消耗,会导致溶解氧浓度迅速改变。溶氧控制的分批补料培养控制的几个关键参数如下：1、温度：培养温度为37℃。2、pH：自动流加30%的氨水，使PH保持在7.0左右。3、葡萄糖的流加：根据发酵的实际经验，流加补料分三个阶段进行，发酵过程中0~4h不加补料，4~10h补加含50g葡萄糖的补料，10~20h加入含190g葡萄糖的补料，诱导前0.5h追加100ml补料。放罐发酵8小时后，测OD值及还原糖量，当发酵液的PH不断上升且为碱性、OD值增长缓慢，且还原糖量很低时，可判断发酵结束，准备放罐。放罐操作同取样。将全部发酵液取出后，100℃煮沸10分钟灭菌，灭完菌的发酵液可排放入下水道。清洗放罐完毕后，打开自来水进水口，往发酵罐中注满水，同时开动搅拌轴搅动清洗五分钟，排水。再次注入自来水清洗，操作如1。清洗结束，关闭电源。注意事项首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。第三，选