6-基因克隆与基因体外表达-研究生

1第八章基因克隆与基因体外表达GeneCloningandGeneExpression主讲：陈慧勇分子生物学研究中心分子生物学MedicalMolecularBiology2基因克隆是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节元件（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。3第一节基因克隆的工具酶一、限制性核酸内切酶（restrictionenzyme）它是一种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。452．限制性内切酶的命名EcoRⅠE代表Escherichia属co代表coli种R代表RY13株63．限制性内切酶的识别和切割位点通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ黏性末端（stickyend）。如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端7PstⅠ切割后产生3ˊ黏性末端：有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Bluntend）,如SmaⅠ：8二、其他常用的工具酶1.DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseI)有聚合酶活性有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性有5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性91011122.DNA聚合酶Ⅰ大片段DNA聚合酶Ⅰ大片段(largefragmentofDNApolymeraseI)为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenowfragment）。有5ˊ→3ˊ聚合酶活性有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性13Klenow片段的主要用途有：(1)补齐双链DNA的3ˊ末端。14(2)通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。5ˊ-G-OHKlenow5ˊ-GTT*A*A-OH3ˊ-CAATT-OHd*ATP,dTTP3ˊ-CAATT-OH(3)在cDNA克隆中，第二股链的合成。(4)DNA序列分析。153.逆转录酶（reversetranscriptase）是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA，合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无3ˊ→5ˊ外切酶活性。用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。16174.T4DNA连接酶（T4DNAligase）T4DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的DNA两端连接起来。18195.碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）能去除DNA或RNA5ˊ端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。20216.末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT），简称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到DNA的3ˊ-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。2223第二节基因克隆的载体一、常用的克隆载体(一)质粒（plasmid）质粒是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。24作为克隆载体的质粒应具备下列特点：（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，β-半乳糖苷酶基因（LacZ）等。（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。25262728质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。29(二)λ噬菌体噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌的病毒，用作克隆载体的噬菌体有两种：一种是λ噬菌体，另一种是M13噬菌体。野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。λ噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。目前应用较广的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。3031λgt10和λgt11载体适用于建立cDNA文库。这两个载体都属插入型载体，能克隆7kb以下的外源DNA。λgt11为表达型载体。32λZiplox载体33(三)黏性质粒（cosmid）黏性质粒是由λ噬菌体的噬菌体的黏性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达40～50kb。34(四)M13噬菌体M13噬菌体（M13phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长约6.5kb。M13感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。35当每个细菌体内的复制型M13拷贝数积累到100～200后，M13的合成就变得不对称，只有其中一条链进行复制，产生大量的单链DNA，并被包装到成熟的噬菌体颗粒中，然后从细菌中排出。M13噬菌体的最大优点在于从细菌体内释放出的颗粒中所含的单链DNA。3637(五)病毒载体逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。38二、表达载体(一)原核表达载体表达载体中含有复制起始位点、抗性基因、克隆位点、启动子、核糖体结合位点和转录终止信号.3940(二)真核表达载体载体中含有原核复制起始位点、抗生素抗性基因.还含有真核表达元件,包括启动子、增强子、克隆位点、转录终止信号和poly(A)加尾信号.41第三节基因克隆的基本过程基因克隆主要分为以下几个步骤：①制备目的基因和相关载体；②将目的基因和有关载体进行连接；③将重组的DNA导入受体细胞；④DNA重组体的筛选和鉴定；⑤DNA重组体的扩增、表达和其他研究。42一、目的基因的获得（一）从基因组文库中获得一个生物体的基因组ＤＮＡ用限制性内切酶部分酶切后,将酶切片段克隆在载体ＤＮＡ分子中,所有这些插入了基因组ＤＮＡ片段的载体分子的集合体,将包含了这个生物体的整个基因组,也就是构成了这个生物体的基因文库。43（二）从cDNA文库（cDNAlibrary）中获得cDNA文库是指某种特定细胞及特定状态下的全部cDNA克隆.（三）用聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增有关DNA片段（四）人工合成44二.载体的选择45三、DNA分子的体外连接（一）黏性末端（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（四）平端连接46（一）黏性末端4748定向克隆49（二）人工接头50（三）加入同聚体尾51（四）平端连接52四、外源DNA导入宿主细胞将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞，常用的方法有以下几种。（一）转化（transformation）（二）感染（infection）（三）转染（transfection）53（一）转化（transformation）转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌，并处于感受态，称为感受态细胞（competentcell）。54（二）感染（infection）λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内繁殖。由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（transduction）。55（三）转染（transfection）转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。56五、目的基因的筛选和鉴定将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。57（一）遗传学方法1.抗生素筛选法(1)单抗生素筛选大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素（ampicillin,Amp）、四环素(tetracycline,Tet)、卡那霉素(kanamycin,Kan)抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。用该法可筛选出转化子，但不能区分含目的基因的转化子和不含目的基因的转化子。58（2）双抗生素筛选5960含有两个或两个以上选择标志的载体,如pBR322带有Amp和Tet抗性基因，将外源基因插入Tet基因内，则Tet基因失活，所构建的重组质粒转化菌落能在含Amp的培养板中生长，而不能在含Tet的培养板中生长。612.蓝-白筛选（α互补）许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α互补。6263（二）免疫学方法如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。6465（三）核酸杂交法对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。66菌落原位杂交的原理67（四）PCR技术PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。68(五)酶切鉴定用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。（1）插入片段大小的鉴定（2）插入片段方向性的鉴定69目的基因正向插入和反向插入的示意图7071第四节真核细胞转染一、真核细胞转染的方法与基本原理（一）磷酸钙沉淀法（calciumphosphateco-precipitation）使外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙混合，形成微小颗粒，并加入到宿主细胞中，使这些颗粒沉积在细胞表面，以利于宿主细胞摄取这些颗粒。72（二）电穿孔法（electroporation）将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流的作用下，细胞膜出现许多小孔，使外源DNA能进入宿主细胞。73（三）DEAE-葡聚糖（DEAE-Dextran）法外源DNA或重组质粒DNA与DEAE葡聚糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的化学基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团结合，并粘附于细胞表面，借助细胞内吞过程促进外源DNA进入细胞。74（四）脂质体介导的基因导入DNA75（五）显微注射法（microinjection）76二、转染细胞的筛选(一)TK-细胞突变株筛选转染细胞细胞内TTP的合成有两条途径从头合成可被氨基喋呤阻断补救合成胸苷激酶(TK)是关键酶TK+:细胞生长TK-细胞导入含TK基因的载体:细胞在HAT培养基生长77（二）药物筛选转染细胞新霉素抗性基因（neor）编码氨基糖苷磷酸转移酶，使氨基糖苷抗生素G-418（新霉素衍生物）失活。G-418阻断细胞内的蛋白质合成，从而达到杀伤真核细胞的目的。78（一）寡核苷酸介导的定点诱变法第五节基因的改造诱变引物通用引物Klenow片段，dNTPT4DNA连接酶转化大肠杆菌标记诱变引物原位分子杂交放射自显影79（二）含U模板法80（三）PCR介导的定点诱变法81第六节克隆基因的表达一、大肠杆菌表达系统（一）基因表达的基本要素1．目的基因目的基因如果来自真核细胞必须是cDNA。cDNA的始密码子（ATG）上游部分（5ˊ端非编码区）必须除去。对于一些分泌性蛋白，还应除去信号肽部分。822．载体的选择所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子（如PL、tac、T7等）和SD序列。833．目的基因与载体的连接（1）起始密码子（2）融合蛋白融合蛋白是指表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起。8485864．受体菌株和诱导条件•根据载体启动子选择菌株•确定诱导表达条件87（二）提高外源基因表达水平