HPLC在药物分析中的应用

高效液相色谱及其在药物分析中的应用摘要：高效液相色谱法的发展非常迅猛，许许多多的新方法不断涌现，它具有分离效率高，选择性好，分析速度快，操作自动化和应用范围广的特点。本文主要简单介绍高效液相色谱的知识及其在药物分析中的广泛应用，通过实例描述了高效液相色谱法的优点。高效液相色谱(HPLC)是结合经典液相色谱及气相色谱的分离原理。由于与气相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广②可选用不同性质的各种溶剂作为流动相，而且流动相对分离的选择性有很大作用，因此分离选择性高；③一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。因而广泛应用于生物化学，生物医学，石油化工，合成化学，环境监测，食品卫生，以及商检，法检和质检等许多分析检验部门。高效液相色谱不仅仅是一种有力的分析工具，而且越益成为分离制备和纯化的手段。液相色谱在国内和国外已被广泛地应用于药物分析，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。中国药典1985年版才规定使用，该版只有8个品种规定使用HPLC方法检测，到了1995版达到113个品种，2000版药典的应用达到了282种，2005版仅药典一部的应用达到了479种，涉及518项；药典二部中采用高效液相色谱法的品种有848种，较2000年版增加了566次，其中复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法。2010年药典则更多的用液相色谱法取代了某些药物含量测定的薄层法，并引入了各式各样的检测器。由此可见，我国高效液相色谱法在药物分析中的重要性。1.高效液相色谱仪的进展高效液相色谱(HPLC)是20世纪70年代迅速发展起来的一种分离分析技术，是目前各种色谱模式中应用最广的一个领域。据估计，世界上几百万种化合物中除20％宜用气相色谱(Gc)分离分析外，其余80％的化合物，包括大(高)分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC(正相HPLC、反相HPLC、离子交换色谱和离子色谱、体积排除色谱、亲合色谱等)进行分离分析。因此，自80年代以来HPLC成为国际分析化学界发展最快的一个分支，无论是仪器的销售额，还是论文的发表数，均雄居同期所有分析仪器的首位，在很多学科领域内都得到了广泛的应用。HPLC仪器一般由输液系统、进样器（现有很多的都是自动进样系统）、色谱柱、检测器和计算机控制系统(工作站)组成（如图1），制备型仪器还配有馏份收集系统。其中，输液系统主要有高压输液泵，有的仪器还有在线脱气和梯度洗脱装置，如液相色谱仪安捷伦1200四元系统可以在使用不同溶剂的方法之间进行快速切换，可以使用二元、三元和四元梯度，还有岛津仪器自动进样，自动化仪器控制和数据处理。检测器用于连续检测色谱柱流出的物质，进行定性定量分析。要求其灵敏度高、噪音小、基线稳定、响应值的线性范围宽等。常用的有紫外检测器，包括光二极管阵列检测器，可快速提供检测物的紫外光谱，以帮助鉴别。蒸发光散射检测器适用于检测挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等，但是其灵敏度较低，此外，流动相必须是挥发性的，不能含有缓冲盐等。荧光检测器只适用于能产生荧光的物质，如生物胺、维生素和甾体化合物等。安培检测器尤其适用于痕量组分的分析，具有氧化还原活性的物质都能检测，如活体透析液中生物胺，酚、羰基化合物等。而液相色谱-质谱联用技术，接口部分巳取得重要进展。由粒子束、热喷雾，发展到最近的电喷雾接口，联用技术日趋成熟，性能大大改进。液相色谱-质谱联用能给出分析物的质谱图，提供分析物的结构信息，对鉴别非常有利。液相色谱一双质变联用增加了分离能力，并提供更多的结构信息，检测灵敏度也大大提高。2.高效液相色谱在药物分析中的应用高效液相色谱在药物分析中的应用范围越来越广，高效液相色谱由于具有高选择性、高灵敏度，并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点，已成为医药研究的有力工具。如在中草药有效成分的分离和纯度测定、人工合成药物成分的定性和定量测定、新型高效手性药物中手性对映体含量的测定以及药物代谢物的测定等方面都需要用到HPLC的不同测定方法予以解决。而目前高效液相色谱的蒸发光散射检测器的应用更体现了它在药物分析中的重要地位。2.1天然药物分析天然药物的来源有动物、植物和矿物之分，其中以植物类为主。由于天然药物的化学成分复杂，其有效成分，可能有一个，也可以有多个，这对于控制药品质量，建立质量标准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行分离鉴定，再测定有效成分的含量；通过指纹图谱建立识别模式，可以判定药材的质量高低。2.2天然药物及复方成药分析复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法。增免扶正片系由当归、党参、黄芪等十几味天然药物精制而成，具有益气生津、活血养血、滋补肝肾、健脾开胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，长期服用可扶正祛邪，提高机体免疫功能，健身强体，益寿延年。该药对心、肝、脾、肾虚、纳差、心脑血管疾病、神经衰弱、慢性肝炎、脂肪肝等都有较好的防治作用。由于化学药品的开发费用昂贵，而且毒副作用大，近年来人们已把目光转向自然、民族传统医药、草药、植物药等天然药物，据世界卫生组织统计，当前全世界60多亿人口中80％的人使用过天然医药。在全世界药品市场中，天然物质制成的药品已占30％，国际上植物药市场份额已达300亿美元，且每年以20％以上的速度增长。HPLC分析必定能为我国传统中医药实现现代化，走向世界提供强有力的技术支持。2.3抗生素分析如甲磺酸帕珠沙星，阿奇霉素，乳酸左氧氟沙星，氟罗沙星等品种的大容量注射液的鉴别，含量测定，相关物质的测定等都采用的是HPLC法，其避免了抗生素的高浓度下抑菌性强，微生物法时间长，专一性差的特点。2.4手性药物分析在生物体内，几乎所有具有重要生理意义的有机生物分子都有手性(chirality)，绝大多数都是旋光性物质。两种化学组成、分子式完全相同的化合物，但因组成化合物的原子在空间取向不同，而成为镜像的化合物，称为手性化合物。由于对映体的物理、化学性质相同，实现它们的分离就比较困难，如大多数氨基酸都有右旋体和左旋体，但往往只能获得右旋体和左旋体的混合物。还有乳酸左氧氟沙星，其对映体右旋属于杂质，在HPLC中就能很好的反应出来。、图-2乳酸左氧氟沙星及其光学异构体的色谱图手性药物往往呈现一种对映体具有强的生物活性和药效，而另一种却无效。近年来，对手性药物的拆分定量分析进行了广泛深入的研究。其中，对生物体液中药物对映体的分离分析，有利于了解各种对映体的药代动力学、体内代谢过程和生物利用度。因此对手性药物对映体的拆分也是HPLC分析的热点。手性HPLC拆分法是以现代HPLC技术为基础引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异而进行分离。HPLC法拆分手性药物对映体可分为直接法和间接法。前者是将不对称中心引入分子间，可分为手性流动相添加剂(CMP)法和手性固定相(CSP)法；后者又称为手性试剂衍生化(CDR)法，它是将不对称中心引入分子内。手性试剂衍生化法是将对映体经手性试剂衍生，生成非对映异构体后，利用常规HPLC方法进行分离和测定。适用于不宜直接拆分测定的化合物如手性脂肪胺类、醇类等。该法分离效果好，分离条件简便，但对手性衍生试剂的要求较高，操作比较麻烦，多在其它方法无法实现时才采用。对生物样品中对映体拆分过程中，由于内源性物质及代谢产物的干扰，单用HPLC分析，易造成谱峰重叠，不能直接分析体内手性药物。目前，使用多柱偶联技术已成功解决了该类问题。目前，HPLC是在手性药物拆分中应用最多的方法之一，可以预见，该方法因其具有快速、方便、精确的特点，在未来的手性药物研究中，将得到更广泛的应用。2.5在鉴别中的应用在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别.2.6在杂质检查中的应用HPLC分离效能高,灵敏,在药物的杂质检查中应用广泛.主要用于药物中有关物质的检查.“有关物质”是指药物中存在的合成原料,中间体,副产物,降解产物等物质,这些物质的结构和性质与药物相似,含量很低,只有采用色谱的方法才能将其分离并检测.若杂质是已知的,又有杂质的对照品,可用杂质对照品做对照进行检查.若杂质是未知的,可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查.如甲磺酸帕珠沙星等莫西沙星等沙星类，还有氟康唑，替硝唑等产品都是用此法做鉴别。min02.557.51012.51517.52022.5mAU020406080VWD1A,波长=310nm(D:\CHEM32\1\DATA\李正群\奥硝唑\奥硝唑有关物质2010-01-1310-36-11\奥Y000003.D)2.4872.8125.2159.97112.502图-3奥硝唑有关物质的色谱图2.7在含量测定中的应用用高效液相色谱法侧定含量可以消除药物中的杂质,制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰.中药材及其制剂组成复杂,基中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了高效液相色谱法.如维生素B2，B6，替硝唑，氟康唑，氟罗沙星，氯霉素等药品，均采用此法测含量。0.02.55.07.510.012.515.017.520.0-1020406090滴耳液眼膏含量测定#3A2UV_VIS_1mAUmin6.9112.05WVL:276nm图-4氯霉素滴耳液的含量测定色谱图2.8在体内药物分析中的应用HPLC由于测定迅速准确，流动相选择范围广，灵敏度高(10-12g／mL以上)，填充柱种类多，且可供选择的检测器也多。所以是实验室研究中一种很好的体内分析方法。在国内外都很受重视．大多数药物都有紫外吸收，所以最常用的检测器是紫外检测器。多数药物及内源性物质极性均较大，利用其极性差，可以采用RP-HPLC色谱柱，可获得良好分离效果。3.液相色谱-质谱联用技术在药物分析中的应用液相色谱-质谱联用技术(LiquidChromatrography-MassSpectrometry)是当代最重要的分离和鉴定方法之一。它是以HPLC为分离手段,MS为检测器的一门综合性分析技术,它集LC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的定性专属特异性于一体,成为药物分析研究中不可或缺的有效工具。液相色谱-质谱联用法(LC/MS)由于弥补了传统LC检测器的不足,在过去的10年中有力地推动了药物分析研究。目前,许多剂量小药效强的药物及其代谢产物多为极性强、难挥发的化合物,而且药物随着生物技术的发展,极性较强的生物活性化合物如多肽和高分子量的蛋白将占有越来越重要的地位。因此LC-MS作为一种高灵敏度和高选择性的方法来分析上述化合物,将在药物分析研究领域中起着重要的作用。尤其是对药物的吸收、分布、代谢和排泄的研究,已部分提前到化合物筛选阶段进行。而LC/MS接口技术的不断改进,与强大的结构分析、定性和定量能力相结合,较好地适应了现代体内药物分析研究对高精密度和准确度分析方法的需求,而获得广泛应用。LC-MS在药物分析领域的应用及其进展质谱作为液相色谱的一个选择性检测器,大大增强了LC的鉴定能力,因此LC-MS是分析和鉴定复杂混合物的强有力的工具,尤其适用于痕量测定的药物分析领域,其在药物分析领域的应用已有所报道。液相色谱-质谱联用技术体现了色谱和质谱优势的互补,将色谱的高分离性能和质谱鉴别力强的特点相结合,组成了较完善的现代分析技术。正是由于液相色谱-质谱联用法具有高度的专属性,对多数药物的检测灵敏度超过其他分析方法,使定量测试速度显著加快,可以对混合物中的微量组分进行结构分析,适应了现代体内药物分析研究中高通量和高精度的要求,无疑已经成为药物动力学和代谢研究的核心分析技术。而且随着现代化高新技术的不断发展及液相色谱-质谱联用技术自身