实验四

细胞与遗传实验杨玲细胞与遗传医学系遗传分析一、实验目的系谱分析&绘制系谱加深对遗传学的基本原理和遗传规律的理解掌握系谱的绘制和分析方法初步学会判断遗传方式及对系谱中成员发病危险率进行估计二、实验原理系谱分析（pedigreeanalysis）：分析家系中各成员的表型，以此来推断某一性状或某一疾病在该家系中的遗传方式。如果是单基因遗传，还可确定是显性、隐性或性连锁遗传。基本程序是先对某家族各成员出现的某种遗传病的情况进行详细调查，再以特定的符号和格式绘制成反映家族各成员相互关系和发生情况的图解，然后根据孟德尔定律对各成员的表现型和基因型进行分析。如何判断遗传方式？①确定显性遗传还是隐性遗传(区别是代代遗传还是隔代遗传)②确定常染色体还是性染色体遗传(区别男女比例）③初步确定遗传方式后验证---用所学系谱特征。如何估计发病风险？具体情况具体分析！三、系谱分析时须注意的问题1、资料必须可靠，个体的文化程度、家系成员的分散程度、被调查者的年龄、记忆和判断能力等，都是影响资料准确度的因素。2、涉及家庭成员的隐私问题，应说服被调查者积极配合。3、对不同患者患病程度的度量应尽量准确一致，最好能提供医院的诊断资料，仅依某一个人的描述往往产生较大的偏差。4、应尽可能地扩大家系范围，以便更准确地判断。5、注意外显不全、延迟显性、新突变基因、动态突变、易位基因、基因组印迹等问题，还要充分考虑主基因和遗传背景、基因和环境综合作用等问题。6、观察指标的不同，可能遗传方式也不同。家系分析的结果对于发病风险率的计算将产生重要影响。四、实验内容－－系谱分析例1：这是一个白色额发（头发中有一绺白色的额发）的系谱，请根据系谱判断白色额发的遗传方式。例2：斑状角膜变性是一种遗传病。儿童期发病，由角膜中央浅层实质层的弥漫性混浊逐渐累及全层，并扩展至角膜周边部。对视力损害极为严重，至40岁时即成盲目。有程度不同的畏光、流泪、异物感等刺激症状。下面是该患者的家系：1．根据该系谱，判断此疾病的遗传方式。2．IV6是杂合子的概率是多少？3．如果V1和V3结婚，那么他们第一个孩子有病的概率是多少？4．如果他们的第一个孩子已经出生，并已知患有此病，那么第二个孩子患病的概率是多少？例3：下面这个系谱是ABO血型和红绿色盲的调查结果：1．判断红绿色盲的遗传方式，判断依据是什么？2．III9的色盲基因是从哪一个传递而来的？3．如果III1与III7结婚，他们生男孩是色盲的可能性有多大？4．如果III7与III10结婚，所生正常表型女孩为色盲基因携带者的可能性为多大？表现为色盲的可能性为多大？5．如果对这家系中I，II代血型判断无误的话，那么第III代中有一个个体的血型的判断是错误的，是哪一个？6．如果对“血型记录错误者”及他的母亲判断是正确的话，试推断他父亲的血型？绘制系谱系谱图中必须给出的信息包括:性别、性状表现、亲子关系、世代数以及每一个个体在世代中的位置。由于系谱法是在表现型的水平上进行分析，而且这些系谱图记录的家系中世代数少、后代个体少，所以，为了确定一种单基因遗传病的遗传方式，往往需要得到多个具有该遗传病家系的系谱图，并进行合并分析。系谱图的绘制方法常以该家系中首次确诊的患者又称先证者(proband)开始，追溯其直系和旁系各世代成员及该病患者在家族亲属中的分布情况。根据绘制的系谱图进行分析，又称系谱分析,以确定该家系是否患有遗传病及其可能的遗传方式。绘制系谱方法：用所学符号表示家系中的个体及个体之间的关系。①同一代成员应在同一水平线上，标明代号（罗马数字）和成员序号（阿拉伯数字）；②一般调查到患者的三代亲属；③符号大小一致，姐妹弟兄方向不要画反。四、实验内容－－绘制系谱病例1．有一女患者因惊厥就诊，其母代述：这是第3个孩子，她的两个哥哥和一个妹妹都很正常，这孩子刚生下来也正常，但随着年龄的增长，智力逐渐低下，毛发由黑逐渐变黄，肤色由深变浅。患者父母双方的三代人都未得过此病，但患者的父母是姑表兄妹。医生诊断孩子是苯丙酮尿症病例2．一多指畸形男患者（先证者）就医要求手术，经调查，其姐姐为患者，妹妹正常，其父亲为患者，母亲正常。先证者叔父夫妇双方及其儿子正常。先证者的祖父为患者，祖母正常。传代培养细胞染色体标本的制备原理在细胞的生长周期中，中期染色体的长短、大小、恒定性正适合对其进行分析、研究。因此利用人工的方法，使细胞分裂处于中期而不向后期转化，并收获细胞，经处理，制片后观察分析。器材与试剂培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天平等。试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰载玻片等。器材与试剂L02细胞含10%小牛血清DMEM秋水仙素（5微克/毫升）0.075MKcl固定液（甲醇/冰乙酸3:1）Giemsa染液。操作1、细胞培养2、秋水仙素处理：终止培养前4h加秋水仙素（终浓度为0.07ug/ml），混匀，37℃继续培养。3、收集细胞：胰酶消化细胞（方法同细胞传代），用培养液将细胞收集到离心管中，1500r/min离心，10min。5、低渗处理：弃上清，加8ml0.075MKCl溶液，混匀，置37℃水浴15min。操作6、预固定：低渗处理后，加1ml固定液混匀，1500r/min离心，10min。7、固定：弃上清，加8ml固定液，混匀，室温静置15min，1500r/min离心，10min。8、再固定：同上（省略）。9、制备细胞悬液：弃上清，视细胞数量多少加适量固定液制成细胞悬液。10、制片：取细胞悬液2-3滴，滴于冰玻片上，并迅速吹片，酒精灯火焰烤干。11、烤片：37℃14天---G显带。注意事项胰酶消化细胞的时间一定要控制好秋水仙素的浓度及处理时间很重要。低渗液的浓度与处理时间应掌握好。固定液应临用时新鲜配制，固定时一定要彻底打匀。