基因工程复习知识点-内蒙古农业大学

基因工程知识点总结代课老师尹俊10级生计2左俊整理1《基因工程》复习参考知识点总结代课教师：尹俊整理：左俊说明：○1内容来源：网络，笔记，教材和个人理解。个人整理错误或者理解有误的地方，请自行改正，本人整理内容仅供参考。○2时间有限，整理仓促，资料有限，导致内容详略不一，请参考老师给的重点，添加缺少的内容，较详细啰嗦的内容可选择性参考。○3内容前后安排大致和老师所讲的顺序以及教材保持顺序一致。绪论（内容略）基因工程基本技术分子杂交分子杂交（hybridization):有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补退火形成稳定的双链分子的过程。Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交进行检测。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交进行检测。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。Western印迹法：检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤:(1)DNA提取(2)酶切DNA(3)凝胶电泳分离各酶切片段(4)使DNA原位变性(5)转膜(6)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点(7)探针与DNA杂交(8)通过放射自显影检查目的DNANorthern杂交步骤：(1)取表达目的基因的组织样品(2)总RNA提取(3)分离mRNA(4)RNA电泳(5)转膜(6)预杂交(7)探针杂交(8)放射自显影原位杂交基因工程知识点总结代课老师尹俊10级生计2左俊整理2原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA，再将DNA烘干固定于膜上，与标记的探针杂交，检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。组织原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。PCRPCR原理：变性温度下，DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。影响PCR扩增的影响因素：(1)聚合酶（TaqDNA聚合酶，易在3′末端加A；Pfu聚合酶，高保真性，合成长片段和平末端）(2)dNTPs的浓度；(3)模板：主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。(4)引物浓度：0.1-0.5µmol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体；(5)Mg2+浓度：常用0.5-2.5mmol/L，影响酶的活性、引物-模板退火、特异性；(6)PCR反应程序设定：变性温度和时间、引物退火温度Tm与时间、引物延伸温度与时间和循环数引物设计原则：（1）引物长度以18-25bp为宜。（2）碱基尽可能随机分布,G+C占20-80%。（3）引物内部避免形成二级结构。（4）两引物间避免有互补序列。（5）引物3’端为关键碱基，必须完全互补；5’端无严格限制，可加入酶切位点。（6）上下游引物退火温度相差5℃以内。（7）内部避免重复序列。PCR特点：○1特异性强○2敏感性高○3快速○4简便○5可扩增RNA或cDNA○6对起始材料质量要求低○7单核苷酸错误掺入PCR分类1)不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板.制备杂交探针.基因组DNA结构功能的研究2)反向PCR(reversePCR)：用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。3）定量PCR定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。目前主要有两种方法：荧光探针技术和双链DNA特异结合染料。PCR的应用：基因组克隆；基因合成；遗传病的诊断和研究；性别鉴定等。基因工程知识点总结代课老师尹俊10级生计2左俊整理3TA克隆：利用PCR反应中所使用的聚合酶具有在3′加上A的末端转移的活性，使PCR产物与一个具有3′-T突出的载体DNA连接起来的方法DNA测序方法Sanger双脱氧链终止法原理：在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。基因工程工具酶DNA聚合酶（1）大肠杆菌DNA聚合酶I基本性质：5’→3’的DNA聚合酶活性;5’→3’的核酸外切酶活性；3’→5’的核酸外切酶活性。基本用途：缺口前移：Nicktranslation（切口平移）；制备³²P标记的探针。（2）Klenowfragment①Klenowfragment的性质：具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性。（失去了5’→3’外切酶活性）。②基本用途末端补齐（补平5′突出末端，切除3′突出末端）DNA3’末端标记（在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP）在cDNA克隆中，用于cDNA第二链的合成。双脱氧末端终止法测定DNA序列（3）T4DNA聚合酶①基本特性：a.具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性。b.在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切c.在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止d.在有四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。②基本用途a.补平隐蔽末端；b.DNA3’末端标记（4）T7DNA聚合酶②T7DNA聚合酶的特点：持续合成能力强：一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。3’→5’外切酶活性高：单链和双链都能降解。不受DNA二级结构的影响③T7DNA聚合酶的用途以大分子量DNA为模板的合成：如M13进行末端标记：与T4DNA聚合酶相同补平隐蔽末端：合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。（5）修饰后的T7DNA聚合酶①T7DNA聚合酶的化学修饰去除3’→5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。②修饰后的T7DNA聚合酶的用途基因工程知识点总结代课老师尹俊10级生计2左俊整理4Sanger双脱氧链终止法对长片段DNA进行测序的理想用酶标记DNA3’隐蔽末端③更有效地补平末端（6）Taq-DNA聚合酶具有耐95℃左右高温达30min以上的特性；催化5’→3’的DNA新链合成，最适温度68～72℃，合成速度1200bases/min；在合成的DNA链的3’端常多一个“A”；不具3’→5’的外切酶活性,即无校正功能，大约每合成500个碱基要错配一个；具微弱的5’→3’的DNA外切酶活性。（7）pfu聚合酶具有耐95℃左右高温达30min以上的特性；催化5’→3’的DNA新链合成，最适温度68～72℃，合成速度600bases/min；合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A；合成的DNA片段长度在2kb以内；具3’→5’的外切酶活性,即有校正功能；无5’→3’的DNA外切酶活性。（10）依赖于RNA的DNA聚合酶反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链①M-MuLV:鼠源RT,来源于鼠白血病病毒(MoloneyMurineLeukemiaVirus)最适温度42℃,以RNA、DNA或RNA∶DNA杂分子为模板，需引物，需Mg2+或Mn2+为辅助因子，具有RNaseH活性，特异性地对RNA∶DNA杂分子中的RNA降解②禽源RT,来源于鸡成髓细胞增多症病毒(AvianMyeloblastosisvirus)（特点同上）③CLONETECH公司的专利产品，源于M-MuLV的一个点突变。无RNaseH活性，故合成的cDNA不会因此变短。具有末端转移酶活性，倾向加3个“C”。用于合成全长cDNA。核酸酶核酸酶Ⅲ，切割双链DNA，不能降解突出3′末端，可降解平末端。绿豆核酸酶，降解单链DNA，3′和5′都能降解，产生平末端。Bal31核酸酶，单链内切双链外切的核酸酶，3′和5′末端切割速度不同，可产生粘性末端。S1核酸酶，切割单链RNA和单链DNA，降解由限制性内切酶切割形成的3或5突出末端，切割双链中未配对的单链区域，低浓度切割单链，高浓度可切割双链。限制性内切酶命名限制性酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的个一个首字母，再加上序号，A、第一个字母大写，表示该酶来源的细菌属名的第一个字母B、第二、三个字母小写，表示该酶来源的细菌的种名的前2个字母C、第四个字母大写代表不同的变种/品系小写代表不同的菌株和型D、最后罗马字母，代表同一菌株中不同的限制性内切酶注意限制性内切酶的正确写法：1、前3个字母一定斜体2、字母与罗马数字间空格如：EcoRIPstI影响限制性核酸内切酶活性的因素①DNA样品的纯度蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等解决方法：加大酶的用量，1mgDNA用10U酶；加大反应总体积，延长反应时间。基因工程知识点总结代课老师尹俊10级生计2左俊整理5②DNA甲基化程度③反应条件高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即Staractivity现象。EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%，可切割5‘PuPuATPyPy3’④酶的纯度⑤酶切反应的温度和时间大多数的内切酶，最适反应温度为37度，但也有例外，如SmaI为25度。酶解时间可以通过加大酶量而缩短。星号活性:在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为同裂酶:识别相同序列的限制性内切酶称为～。它们的切割位点可能不同同序同切酶:识别序列和切割位置都相同同序异切酶（Isoschizomer):识别序列相同，但切割位点不同同功多位酶：许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能同尾酶（Isocaudarner）:不同的限制性内切酶切割DNA产生的末端是相同的，切是对称的，即相同的粘性末端DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶需要NAD作物辅助因子只能连接粘性末端。（2）T4噬菌体DNA连接酶以ATP作为辅助因子；不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端；RNA:DNA杂交分子中RNA上的缺口。连接条件①必须是两条双链DNA。②DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。③需要能量动物或噬菌体中：ATP；大肠杆菌中：NAD+④只能连接相邻核苷酸之间的缺口，不能连接gap，可以连接nick。核酸修饰酶1.末端脱氧核苷酸转移酶5’→3’DNA聚合酶活性①末端转移酶的特性：需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。不需要模板。底物可以是单链DNA是3’—OH突出的双，随机添加的dNTPs，如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。②末端转移酶的用途：同聚物加尾：给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。再生酶切位点：便于回收克隆片断。非放射性标记DNA片断的3’端：催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。（生物素-11-dUTP等）2.T4多核苷酸