藻胆蛋白质的提取纯化与生物活性研究进展

·综述与专论·生物技术通报　2010年第1期藻胆蛋白质的提取纯化与生物活性研究进展张唐伟1,2　李天才1(1中国科学院西北高原生物研究所,西宁810008;2中国科学院研究生院,北京100049)　　摘　要:　藻胆蛋白的提取原料主要来自于红藻和蓝藻;细胞破碎的方法主要有反复冻融法、化学试剂处理法等5种方法;提取的方法主要有盐析法等3种;分离纯化的方法主要有层析法等3种;藻胆蛋白其生物活性主要表现在:抗肿瘤活性、抗病毒活性、抗氧化和消炎活性,提高免疫活性。关键词:　藻胆蛋白提取纯化生物活性1.21(1,,810008;2,,100049)　　:　,.,,-.-,-.-,,-,.:　收稿日期:2009-10-10作者简介:张唐伟,男,硕士研究生,研究方向:药用植物化学;-:04@163.通讯作者:李天才,-:@..藻胆蛋白(,)是藻类特有的捕光色素蛋白,主要包括藻蓝蛋白()、藻红蛋白()和别藻蓝蛋白(-)3类[1]。藻类适应性强,养殖成本低,适宜规模化生产,被联合国粮农组织推荐为人类明天最理想的食品[2]。藻胆蛋白用途极为广泛,可作为天然色素应用于食品、化妆品、染料等工业,又可制成荧光试剂,用于临床医学诊断和免疫化学等研究领域中,同时藻胆蛋白具有抗氧化、提高机体免疫力和抗肿瘤等重要生理功能,是保健品及药品等的重要资源。1　藻胆蛋白的提取1.1　提取原料不同藻类中蛋白质的种类和含量不同,藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白在所有的蓝藻和红藻中都有分布,藻红蛋白则只出现于红藻和部分蓝藻中,所以藻胆蛋白的提取原料来自于红藻和蓝藻。新鲜海藻中藻胆蛋白含量要比晒干或加工后的含量高[3]。余九九等[4]认为以新鲜藻泥为原料比用喷雾干燥后的藻粉提取效果好。藻胆蛋白一般最高含量约为海藻干重的2%左右,但一些经过培养的螺旋藻,其藻胆蛋白含量可达干重的18%[2],'等[5]甚至培养出藻胆蛋白含量高达24%的蓝藻。林红卫、彭卫民等[6,7]从钝顶螺旋藻中提取藻红蛋白和藻蓝蛋白等藻胆蛋白,王广策、张建平等[8-13]分别从多管藻、条斑紫菜、坛紫菜、红毛藻、地木耳为原料分离得到藻胆蛋白。提取藻胆蛋白的原料不同,藻胆蛋白的含量也有所不同,要根据自己的试验需要选择合适生物技术通报　2010年第1期的原料进行提取,才能得到较高的得率。1.2　细胞破碎方法藻胆蛋白属于胞内蛋白质,要提取分离藻胆蛋白,首先必须要破坏藻类细胞的细胞壁、细胞膜,使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来,并保持其活性。目前用于藻胆蛋白提取分离过程中的细胞破碎方法主要有以下几种。1.2.1　反复冻融法　使用该法时结冰时间和结冰、溶解次数对藻胆蛋白的提取量有重要影响。李邵蓉、余丽君等用该法破碎和螺旋藻细胞提取相应的藻胆蛋白[14,15]。张薇君等[16]用该法试验结果表明,未经冷冻时,因大量色素不能析出,致使吸光度值严重偏低,一次冷冻8以上或4重复冻融2次后,其色素蛋白含量趋于稳定,重复次数增多,既耗时且易造成损失。该法操作简单、方便,适用于实验室中少量藻体材料的处理。1.2.2　超声波破碎法　杨立红等[17]用92-2型超声波细胞粉碎仪破碎鱼腥藻细胞的最佳处理条件是超声仪的功率为600,超声时间为9,固液比为1∶8,破壁容量为20。该法常作为辅助方法,还须与其它方法合用以最大限度破碎细胞,且超声波破碎细胞产热较大,易引起藻胆蛋白的变性,多用在实验室操作。1.2.3　组织捣碎法　汤朝晖等[18]曾先用冻融法,再用该法来破碎钝顶螺旋藻细胞以提取藻胆蛋白。陈芳等[19]将藻体与少量石英砂混合加入适当的提取液制成糊状物用高速组织捣碎机破碎藻体的方法从条斑紫菜中提取藻胆蛋白。1.2.4　化学试剂处理法　张以芳等用和溶菌酶联合作用于螺旋藻细胞壁提取藻蓝蛋白,破壁率达95%以上,提取率可达13%[20]。林红卫等[6]利用十二烷基苯磺酸钠破坏钝顶螺旋藻细胞膜提取藻蓝蛋白,提取率高达98%,并明显优于用冻融法提取的对照组。张建平等[9]则用0.2%3溶液浸泡多管藻4-5,破坏细胞膜,从而提取藻胆蛋白。该法适用于大量样品的制备,但是因加入化学试剂,后期的纯化难度增加,且操作不好容易引起蛋白变性。1.2.5　溶胀法程凌江等[10]直接用水浸泡条斑紫菜可得到含藻红蛋白的提取液;韦萍等[21]研究了极大螺旋藻的藻蓝蛋白的提取结果表明,用15/的3或10/2的浸泡效果较好;余九九等[4]比较了液氮冻融法和超声波法,认为采用蒸馏水或低浓度2溶液40℃条件下浸泡螺旋藻的提取方法效果较好。溶胀法提取周期较长,用蒸馏水要浸泡10,用低浓度2溶液也需要浸泡3-4。上述的各种细胞破碎的方法都有一定的局限性,实际生产中,上述几种方法经常混合使用,以最大的限度破碎藻体细胞,使藻胆蛋白溶出。1.3　提取方法1.3.1　盐析法将大量盐加到蛋白质溶液中,蛋白质胶粒凝结并沉淀析出,因此向细胞破碎液中加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。等[22]研究表明用25%硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出,用30%硫酸铵可将藻蓝蛋白沉淀出,再用50%硫酸铵可将别藻蓝蛋白沉淀出;而也有研究者[7]认为30%和50%硫酸铵盐析出的沉淀物中,藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的比例几乎一样,即无法用硫酸铵盐析将藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白分开。陈芳等[19]用50%的硫酸铵盐析条斑紫菜中的藻胆蛋白。该法使用简单方便,但不利于以后的分离纯化。1.3.2　等电点沉淀法汤朝晖等[18]用该法沉淀得到了混有3种藻胆蛋白的混合物,并研究了藻胆蛋白在不同值下的稳定性,认为藻胆蛋白对值较敏感。藻胆蛋白对敏感,使用该法时需注意引起藻胆蛋白的变性。1.3.3　超滤法运用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液,获得藻胆蛋白粗制品。用3高渗-超滤法分离提纯藻胆蛋白,超滤时选用聚砜膜,在超滤过程中,无机盐和小分子蛋白质,包括小分子的藻毒素透过滤膜而去掉,特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒,提高产品的安全性。3高渗-超滤法是提取藻胆蛋白的简单易行的方法[22,23]。用此法提取的藻胆蛋白是安全无毒的,且易于纯化,脱水方便,产品易于干燥。上述方法中,盐析法在藻胆蛋白的提取中较为常用,而结晶法是藻胆蛋白提取中效果较好的方法,但是提取周期较长。从对藻胆蛋白的提取纯化的大量研究来看,采用反复冻融法和超声波破碎法相结102010年第1期张唐伟等:藻胆蛋白质的提取纯化与生物活性研究进展合破碎细胞,再用硫酸铵盐析沉淀出粗蛋白的方法较为普遍,但是这种工艺较复杂,制得的产品纯度不高,安全性不高。2　藻胆蛋白的分离纯化传统的藻胆蛋白分离纯化多是提取后的藻胆蛋白经过一系列的层析柱组合分离纯化藻胆蛋白。近年来,还出现了一步层析法、利凡诺法和双水相萃取法等新的分离纯化手段。2.1　层析法2.1.1　吸附层析法以往需多次羟基磷灰石法分离纯化藻胆蛋白,但等[24]用一步羟基磷灰石纯化藻蓝蛋白,纯度高达4.78;等[25]采用一步疏水层析柱法纯化藻蓝蛋白,使其纯度达到4.52;等[26]应用单步疏水层析纯化少量别藻蓝蛋白,不仅纯度高,回收率也较高,而大量纯化时疏水层析需结合亲和层析提高别藻蓝蛋白纯度,但是回收率偏低;等[27]采用炭柱纯化纯度为1.18的藻蓝蛋白,纯度达到2.58,若先用壳聚糖沉淀细胞碎片再用炭柱处理,则纯度可达3.96。彭卫民等[28]用吸附层析法对螺旋藻中藻胆蛋白进行提取纯化,获得了纯度较高的藻蓝蛋白,但是该法对别藻蓝蛋白进行提纯发现其纯度较难提高。2.1.2　凝胶层析法等[25]用-150结合-柱纯化藻蓝蛋白;等[29]先用-层析,再用-300纯化藻蓝蛋白,将纯度从4.69提高到了5.12;等[30]先用一步羟基磷灰石层析纯化藻红蛋白,使其纯度从0.24提高到1.43,再经过75柱,纯度高达6.67。张建平等[37]先用羟基磷灰石柱层析,再过-150的葡聚糖凝胶层析柱,得到了较纯的藻蓝蛋白(614/2804.0)。2.1.3　离子交换层析法等[31]用--6一步纯化藻蓝蛋白;等[32]改变传统以离子强度作梯度洗脱的方法,根据藻红蛋白的等电点进行梯度洗脱,仅用-一步层析,就将藻红蛋白纯度从1.402提高至5.6,回收率达67.33%。林红卫等[6]先用硅藻土545柱分级洗脱,再用该法纯化,从螺旋藻中获得初度为4.1的藻蓝蛋白和纯度为4.6的别藻蓝蛋白;李邵蓉等[14]将提取液上--52纤维素柱,提取纯度只有1.9,在上葡聚糖凝胶柱-300,则得到了纯度较高的藻红蛋白。可见单独使用离子交换层析效果并不理想,与其它方法合用,效果才较好。2.2　双水相萃取法等[27]采用12.28%聚乙二醇和11.63%磷酸钾缓冲液形成的双水相体系对藻胆蛋白进行分离,研究发现,在7.2时,一次萃取藻蓝蛋白,使其纯度从3.96提高到5.22,经双水相萃取的藻蓝蛋白再经-离子交换柱,达到了6.69,放大体系提取所得的藻蓝蛋白纯度为5.22,回收率为66%。等[33]也指出了双水相萃取法萃取藻蓝蛋白的最佳条件,聚乙二醇4000-磷酸钾体系,两者体积为0.8,结线长为35.53%,体系6.0时为最优组合,通过超滤去掉聚乙二醇可使藻蓝蛋的纯度达3.52,再次萃取可使纯度升到4.05,总回收率达85%。等[34]采用该法分离藻红蛋白,得出分离容器的高度和直径比(/)会影响两相形成的时间;29%的聚乙二醇1000和9%磷酸钾缓冲液形成的双水相,在结线长为45%,体积比为4.5,7.0,/为0.5时,处理浓度为40%的藻红蛋白提取液体可以使其纯度达到3.2,回收率高达90%。该法具有操作步骤少,时间短,回收率高等优点,同时能使藻胆蛋白在一相中浓缩,并且得到的藻胆蛋白纯度较高。2.3　利凡诺()沉淀法等[35]先在细胞破碎液中加入利凡诺(2-乙氧基-6,9-二氨基吖啶),搅拌过夜提取藻蓝蛋白,纯度为1.60,重复4次后,纯度提高到3.90,上清液经40%的硫酸铵盐盐析后,以-25柱除去利凡诺,使纯度达到4.10,再次以70%的硫酸铵盐析,纯度达到4.30,回收率为45.70%。等[36]还对该法进行改良,使其能同时分离纯化藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白,首先用不含盐的磷酸钾缓冲液破碎细胞,以促进利凡诺与提取液结合,减少利凡诺的处理步骤,彻底分离藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白,提高藻蓝蛋白的纯度和产量。由此可见,利凡诺沉淀法能避免层析等繁杂步骤,提高效率。11生物技术通报　2010年第1期3　藻胆蛋白的生物活性研究3.1　抗肿瘤作用藻胆蛋白是一种重要的光动力药物的原料,其具有捕光作用即光敏作用,可作为光敏剂用于辅助激光治癌,用于肿瘤和光动力治疗。它对肿瘤细胞比对正常细胞有更强的亲和力,主要在病灶部位富集,吸收光后高效产生自由基和活泼态氧,从而实现对肿瘤细胞的杀伤,有光毒性而没有暗毒性,在人体中代谢快[37,38]。藻红蛋白介导的光动力反应能够有效的抑制肿瘤细胞合成并杀伤癌细胞[39]。1982年,等[40]研究发现,给接种肝癌细胞的小鼠口服藻蓝蛋白后,小鼠存活率比不给药组明显提高,并发现口服藻蓝蛋白组的淋巴细胞活性高于不给药组,这说明藻蓝蛋白对免疫系统有某种刺激和促进作用。3.2　抗病毒活性等[41]证实了从钝顶螺旋藻中提取的酰基载体蛋白()能压制肠道病横纹肌肉瘤细胞和非洲绿猴肾细胞的病毒使其半数有效抑制浓度为(0.045±0.012)/,而且在细胞受感染前用处理的抗病毒效果比感染后处理效果更好。3.3　抗氧化和消炎活性1998年,等[42]率先报道从蓝藻-中提取的藻蓝蛋白具有抗氧化和消炎的作用。他们的研究结果表明,藻蓝蛋白能清除·-和·-自由基,脱氧核糖测定结果与一些非甾体抗炎的数据相同。藻蓝蛋白还能抑制肝脏微粒脂过氧化物生成。张素萍等[43]用竞争反应动力学方法研究3种藻胆蛋白对羟基自由基的清除作用,结果表明3种藻胆蛋白对羟自由基有很强的清除作用。3.4　提高免疫力动物试验表明,藻胆蛋白能提高淋巴细胞活性,通过淋巴系统提高机体免疫力,增强机体的防病抗病能力[28]。日本学者还曾证实藻胆蛋白能促进动物对铁的利用,恢复造血功能。藻蓝蛋白具有较高的促红细胞生成素()活性,它能直接刺激-的形成,对骨髓造血具有刺激作用[