PCR反应体系

PCR反应体系PCR原理PCR（PolymeraseChainReaction）是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。PCR反应体系PCRbuffer01Taq酶02dNTPs03镁离子04引物及探针模板0506PCRbuffer成分浓度作用Tris-HCl10-50mmol/L平衡ph值KCl≤50mmol/L利于引物的退火（产率比较高）NH4+16.6mmol/L特异性比较好小牛血清白蛋白100μg/ml有助于酶的稳定，提高试剂的稳定性。明胶0.01%Tween200.05%～0.1%二硫苏糖醇（DTT）5mmol/lPCR反应缓冲液的目的是给TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。Taq酶5'到3'合成DNA能力5'到3'外切酶活性3'到5'外切酶活性3'端加A延伸速度普通Taq酶有有无有2000base/min热启动Taq酶有有无有2000base/min高保真Taq酶有无有无600base/minTaq酶是从水生栖热菌ThermusAquaticus（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。Mg2+和dNTPs作用浓度偏高偏低Mg2+TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶1.5～2.0mmol/L非特异性扩增产物减少dNTPsDNA合成的原料50～200umol/L导致错配产物减少Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。引物及探针引物是人工合成的一段寡核苷酸序列。一般为20个碱基。引物的序列与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。探针是人工合成的在两端分别标记荧光基团的一段寡核苷酸序列。探针的特异性及退火温度对反应体系影响很大。模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。DNA模板使用量一般为20-200ng。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。RNA模板注意保证其防止RNA降解。其他成分RNasin（RNaseInhibitor）的作用：RNA酶抑制剂，抑制RNA酶的活性。UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。UNG酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。其他成分反转录酶（Reversetranscripatase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。ROX（ROXReferenceDye）一般用于ABI、Stratagene等公司的RealTimePCR扩增仪上。用于消除信号本底以及效正孔之间产生的荧光信号，最大限度的提高了扩增的准确性内参基因是为了平衡不同模板之间的差异。加入浓度50μL体系加入0.1μL25μMROX，终浓度为50nM。