酶与蛋白质工程-第4章-基因表达与蛋白质分离纯化

第四讲基因表达与蛋白质分离纯化蛋白质异源表达的关键问题就是发展克隆基因的表达方法，即找到理想的宿主表达系统目前常用的表达系统有细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞等，这些表达系统各有优缺点基因表达体系基因表达体系原核体系大肠杆菌(Escherichiacoli)遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形成包涵体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰枯草杆菌(Bacillussubtilis)分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体其它乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)基因表达体系真核体系酵母细胞可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;商品化表达体系：酿酒酵母、毕氏酵母、裂殖酵母糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高昆虫细胞可以病毒感染的形式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限哺乳动物细胞/组织可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；表达量不够高，培养成本较高植物细胞/组织植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不便基因表达体系体系选择研究基因功能大肠杆菌、裂殖酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞多肽药物生产大肠杆菌、毕氏酵母、哺乳动物细胞组织疫苗大肠杆菌、酵母、动植物细胞组织单抗生产杂交瘤细胞工业酶生产各种微生物Escherichiacoli•E.coli常与一些食源性疾病有关，但从人体肠道内分离出来的两种命名为K-12和B的良性大肠杆菌菌株却是两种重要实验用菌株。大肠杆菌K-12的基因组的测序工作已于1997年完成。大肠杆菌B菌株自1918年被分离出来后，在1959年被分离为两类实验用菌株：REL606和BL21(DE3)，后者在医学和工业上用于生产蛋白质•由美国、韩国和法国的科学家组成的研究小组完成了对两种实验室常用的大肠杆菌(E.coli)菌株基因组的测序工作，发表在《JournalofMolecularBiology》(2009)•基因组大小4.6Mbp基因表达体系细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低，是目前广泛应用的外源基因表达体系。但缺乏真核细胞特有的加工处理，外源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏Trx·tagHis·tagthrombinS·Tagenterokinase目标蛋白硫氧还蛋白标签凝血酶肠激酶基因表达体系目标蛋白质在大肠杆菌中的表达载体分类•克隆载体：携带插入外源片段的质粒或噬菌体•表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、终止子等），使目的基因能够表达的载体基因表达体系（１）复制起始点（２）选择性基因（一般为抗生素抗性基因）（３）强的、可诱导的启动子（４）强的转录终止序列（５）核糖体结合位点（６）合适的多克隆位点表达载体包括的成分基因表达体系基因表达体系大肠杆菌表达载体分类按蛋白质类型分：单纯表达:如pJLA系列融合表达:融合各种tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc分泌表达:pel/ompT分泌肽按启动子分：lac及衍生的tac,trc,pac,rac等启动子IPTG诱导lamdaphagePL和PR启动子热诱导T7启动子IPTG诱导T5启动子IPTG诱导ara启动子阿拉伯糖诱导基因表达体系常用表达载体pET系列(T7promoter,Novagen公司)pQE系列(T5promoter,Qiagen公司)pMAL系列(周质表达,BioLabs公司)pGEX系列(GST融合表达,Pharmacia公司)pBAD系列(Arabinose诱导型)pTYB系列(CBD融合,可以自我切割,BioLabs)基因的融合•采用DNA重组技术将不同基因或基因片段融合，经合适的表达系统表达后，可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白•构建融合蛋白的基本原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽基因，即可实现两个基因的融合表达基因表达体系•为蛋白质的表达和纯化提供方便•蛋白质结构和功能的研究•获得蛋白质的途径（通过体外切割）•与其它不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白•与报告分子共表达，研究蛋白定位及转基因表达•防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解•改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST•蛋白表达的空间定位：信号肽利用融合技术表达外源基因原因：基因表达体系基因融合的策略•基因融合的方式–信号肽+基因–信号肽+基因+插入序列基因表达体系融合蛋白接头设计和选择将2个或多个不同的模块连接成为一个大分子，其中起连接作用的氨基酸链即为linker，Linker的长度一般是在10-15个氨基酸之间•若使用的linker较长，由于在重组蛋白的生产过程中对蛋白裂解比较敏感，可能会导致融合蛋白产量的降低；同时又涉及免疫原性的问题，因接头序列本身就是新的抗原•应用较短的linker虽可克服蛋白酶分解的问题，但可能使两个大分子相距最近，影响两种蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰，导致蛋白功能丧失，linker序列的组成对融合蛋白的折叠有重大影响•另外，在设计linker序列时，尽量避免二级结构的产生，linker中常见的氨基酸是非极性的疏水氨基酸（Gly、Ser等）基因表达体系融合蛋白技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为“亲和尾”（Affinitytail）的编码序列相连接，这段“亲和尾”可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，使目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来融合蛋白标签基因表达体系•蛋白纯化•蛋白质的检测和定向固定•提高重组蛋白质的产量•增强重组蛋白质的可溶性及稳定性融合标签的功能基因表达体系ProteinAGST（glutathioneS-transferase）CBD(chitin-bindingdomain,BioLabs;cellulose-bindingdomain,Novagen)calmodulin-bindingdomain,Stratagene)MBP(maltose-bindingprotein)GFP(greenfluorescenceprotein)Thioredoxin**二硫键形成Dsb(periplasmaenzymeDsbA,DsbC)**二硫键的形成SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)KSI(ketosteroidisomerase)基本上全部沉淀各种融合蛋白表达载体帮助可溶化帮助分泌到周质可用亲和层析纯化基因表达体系基因表达体系各种用于抗体识别的标记His-tag(6-8Histidine)HA-tag(YPYDVPDYA)Flag-tag(DYKDDDDK)Myc-tag(EQKLISEEDL)T7-tag(MASMTGGQQMG)HSV-tag(QPELAPEDPED)S-tag(KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag(TTDIEMNRLGK)融合蛋白报告分子•将易于检测的蛋白质与目的分子融合表达，可显示目标分子的存在和定位，广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选基因表达体系•作为报告分子必须具备以下特点：–报告分子应不存在于宿主中且易于和内源性基因相区别；–应该有一个简单、快速、灵敏及经济的分析方法来检测报告分子；–报告分子的分析结果应具有很宽的线形范围，以便于分析启动子活性的幅度变化；–报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物的生理活动基因表达体系融合蛋白的专一性切割DTT:↓Cys溴化氰:Met↓Thrombin:LVPR↓GSFactorXa:IEGR↓Enterokinase:DDDDK↓PreScissionTMprotease:LEVLFQ↓GPGenenaseITM:PGAAHY↓TEVprotease:ENLYFQ↓G1.启动子结构对表达效率的影响转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，因此要选择强的可诱导的启动子及相关的调控序列外源基因有效表达影响因素基因表达体系•强启动子：1.表达效率在10-30%；2.由启动子控制的本底转录很低；3.启动子能够由一些简单及经济合算的方式诱导启动如，T7启动子①mRNA的稳定性：细胞内mRNA的浓度由mRNA转录的速率和mRNA降解之差来决定；②翻译的起始：无效的翻译起始多半是蛋白质低表达的最常见问题；③翻译的延伸：遗传密码的简并；④氨基酸的错误搀入；⑤翻译的终止2.有效翻译与基因的高效表达基因表达体系•每种生物对简并密码子的使用频率的差异；•同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量相关；•某些密码子对所有不同基因都是最常用的，如CCG是脯氨酸最常用密码子；•富含宿主不常用密码子的外源基因有可能得不到有效表达3.密码子偏好性基因表达体系•大肠杆菌细胞学结构特点使表达的外源蛋白可能定位在胞内、胞质膜、胞周质、外膜、胞外培养基•（1）胞内表达：小分子蛋白易表达、易水解。大分子蛋白，胞内表达易形成包涵体4.外源蛋白的表达定位基因表达体系•（2）外周质表达：外源基因与信号肽融合，外周质的氧化环境有利于蛋白质正确折叠，外周质中蛋白质降解少，外周质中总蛋白少（4%），目的蛋白容易纯化•（3）细胞外分泌：利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径；利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。分泌至培养基的蛋白容易纯化，减少内源蛋白酶降解基因表达体系•（4）胞质膜定位：常用于含有跨膜区膜蛋白的研究，如G蛋白偶联受体，具有重要的生理和药理学作用•（5）菌体表面定位：大肠杆菌表面蛋白与外源肽或蛋白融合，表达外源肽或蛋白的菌株可用于构建活菌苗、筛选文库，研究蛋白与配体相互作用、细胞间粘附等菌株内蛋白酶太多会导致外源蛋白表达产物不稳定，选用蛋白酶缺失的宿主菌5.宿主菌选择对表达的影响基因表达体系增加细胞培养密度，如分批培养和连续培养；改变培养基的组成及培养条件6.宿主菌培养条件控制对表达效率的影响真核基因在原核细胞中表达及调控•真核基因特点：–启动子不能被原核识别；–mRNA上没有SD序列；–基因内部含内含子；–产物往往需要翻译后加工；–易被原核酶系降解•因此，在原核细胞中表达时应注意三个问题：–基因编码区必须连续；–必须置于原核启动子、终止子和SD序列的控制之下；–产生的mRNA必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠基因表达体系Yeast•芽殖是酵母最常见的无性繁殖方式，即从细胞壁上产生芽体，形成子细胞。酿酒酵母于1996年完成基因组测序•芽殖酵母和裂殖酵母听起来是近亲，但实际上它们在约３亿到４亿年前就分家了，走上不同进化道路。2001年诺贝尔生理学或医学奖获得者、英国帝国癌症研究基金会的保罗·纳斯领导的小组完成裂殖酵母基因组测序工作，发表在《Nature》杂志上•裂殖酵母的基因组含有3条较大的染色体，约1380万个碱基对。分析表明，裂殖酵母只有4824个编码蛋白质的基因，是真核生物中最少的，比芽殖酵母少1000个左右，甚至比一些细菌还少基因表达体系酵母表达系统既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻译后的修饰目标蛋白质在酵母细胞中的表达基因表达体系5'AOX1启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇诱导下可启动外源蛋白的表达；α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化；多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点；TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号