滴度检测方法

慢病毒滴度检测方法空斑测定法空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。1．5×105细胞/60mm培养皿用5mlDMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。稀释：将100ul病毒保存液加入900ulDMEM5%。用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。换用新枪头将300ul10-1稀释液加入2.7mlDMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。然后分别取300ul前一稀释液加入2.7mlDMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。注意：每次稀释时都必须换用新枪头。3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1mlDMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。50%组织培养感染剂量法此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。细胞准备：1．收集一瓶QBI-293A细胞，计数。2．用DMEM2%准备20ml105/ml细胞。3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。5.8.3.2准备稀释病毒液1．第1管中加入0.9mlDMEM2%，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。2．上下吸打5次混匀。3．换用新枪头。4．从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。名称原理特点优缺点P24核心蛋白定量法ELISAKit物理（颗粒）滴度经典方法，简单、重复性好RNA基因组定量法RT-qPCR物理（核酸）滴度精度高，但对仪器和操作要求高GFP荧光技术法FACS（流式细胞计数）感染滴度经典方法，简单、重复性好抗性克隆技术法细胞克隆计数感染滴度克隆形成需约2周Dot-blot法RNAdot-blot物理（核酸）滴度简单，但属于半定量DNA定量法感染细胞后定量载体DNA感染滴度最接近真实感染滴度，但不同细胞感染效率不同5．反复稀释至最高稀释度。6．用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。7．最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1mlDMEM2%监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。8．37℃培养10天。9．10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。10．计算每一排中出现阳性的孔数。如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本测试即为有效。