层析分离技术..

第8章层析分离知识点：色层分离法的分类及其概念，柱层析技术，吸附层析技术，离交层析技术，生物亲和层析技术，分配层析技术，凝胶过滤技术，电泳技术，薄板层析技术。重点：上述各技术的原理、操作方式、操作过程、所用装置和材料的选择、适用范围，能够灵活熟练地运用这些技术。难点：常用层析法的分类及其合理选用。目录1层析法概述2柱层析3纸层析4薄层层析5吸附层析6分配层析7凝胶过滤8电泳法9毛细管电泳10高效液相色谱1层析法概述1.1引言1.2层析的发展史1.3层析的基本原理及基本概念1.4层析的分类1.5层析剂1.1引言层析原理色谱（层析）法应用范围色谱技术的提出色谱分离图示1.2层析的发展史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938TaylorUray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDeemter提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson创立了毛细管电泳法。1.3层析基本概念层析展开（development）洗脱液(eluate)色谱(Chromatograph)。分配系数洗脱体积：外体积：内体积：正相层析：反相层析：1.4层析分类分类原则类型特征据溶质分子与固定相相互作用的机理不同吸附色谱离子交换色谱疏水作用层金属螯合色谱共价作用色谱分配色谱凝胶过滤亲和色谱吸附力不同各物质与固定相之间的离子交换能力的不同各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同各物质在两液相间的分配系数不同各物质的分子大小或形状不同利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同据实验技术低压色谱中压色谱高压色谱电泳操作压力小于0.5MPa操作压力在0.5～5MPa之间操作压力在5～40MPa之间溶质分子在电场中的移动速度不同据固定相的形状不同柱色谱纸色谱薄层色谱固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水固定相在玻璃平板上铺成薄层据流动相的物态不同气相色谱液相色谱超临界流体色谱流动相为气体流动相为液态流动相为液态按操作方式不同迎头法顶替法洗脱法将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流出，但其它各组分都不能达到分离。利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。吸附色谱与其它色谱法的异同点类型机理优点缺点适用范围吸附色谱化学、物理吸附操作简便易受离子干扰各种生物大分子的分离、脱色、和去热源凝胶过滤分子筛的排阻效应分辨力高，不会引起变性各种凝胶介质昂贵，处理量有限制分子量有明显差别的可溶性生物大分子分配色谱溶质在固定相和流动相中分配系数的差异分辨力高，重复性较好，能分离微量物质影响因子多，上样量太小用于各种生物大分子的分析鉴定亲和色谱亲和色谱生物大分子与配体之间有特殊亲和力分辨力很高一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大各种生物大分子聚焦色谱等电点和离子交换作用分辨力高进口试制昂贵蛋白质和酶1.4层析的分类⑴根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类凝胶过滤法分配层析法离子交换色层分离法吸附层析法疏水作用色层分离法金属螯合色层分离法共价作用色层分离法⑵根据实验技术的分类低压层析技术中压层析技术高压层析技术电泳法——操作压力在0.5MPa-5MPa之间——操作压力在5Mpa-40MPa之间——操作压力小于0.5MPa——靠溶质分子在电场中的移动速度不同而分离⑶根据固定相的形状不同的分类：柱层析法纸层析法薄层层析法⑷根据流动相的物态不同的分类汽相层析法液相层析法液相层析法⑸操作方式不同的分类迎头法顶替法洗脱分析法1.5层析剂种类⑴氧化铝⑵硅胶⑶活性炭⑷琼脂糖⑸纤维素2柱层析法柱色谱法对色谱介质材料的要求常用柱色谱介质的分类柱层析系统的组成柱色谱洗脱方法常用柱色谱介质的分类无机物色谱介质包括：氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙(凝胶型和晶型)、氧化钛和氢氧化锌凝胶等。聚合物色谱介质有：琼脂糖、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等。柱色谱洗脱方法洗脱一般有三种方法：①恒定洗脱法：②逐次洗脱法：③梯度洗脱法：梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。浓度梯度制造器柱色谱系统的组成色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相似，一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成(图2)。柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成：A蠕动泵B层析柱C装柱D加试样E洗脱F检测器G部分收集器柱层析系统的组成柱层析装置图缓冲液管柱梯度制造器监视器记录器分划收集器(1)(2)泵(3)(4)(5)adaptorreservoir胶体装填胶体A3纸层析法3.1基本原理3.2操作方法3.3操作步骤小实验当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。看看接下来会发生什么事情…可以看出1号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。1234这就是纸层析法。对照上图，可知道1-4号的各代表什么氨基酸。纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。1234甘氨酸半胱氨酸组氨酸缬氨酸纸层析小实验动画演示滤纸的选用型号标重(g/m2)厚度(mm)吸水性灰分(%)性能1900.17150-1200.08快速2900.16120-910.08中速3900.1590-600.08慢速41800.34151-1210.08快速51800.32120-910.08中速61800.3090-600.08慢速4薄层层析法4.1薄层层析原理4.2吸附剂及展开剂4.3特殊薄层4.4薄层层析操作要点4.5定性分析4.6定量分析4.7薄层层析应用4.4薄层层析操作要点铺板点样点样量展开显色注：本部分以操作要点注意事项为主，具体过程参见咖啡因的分离分析（动画演示）Doyouunderstand?薄层层析应用示例咖啡因的分离分析（动画演示）图1芍药甙薄层层析扫描图图2丹皮酚薄层层析扫描图5吸附层析法5.1吸附层析定义及原理5.2吸附色层与其他色层分离法的异同点5.3吸附层析的分类5.4无机吸附色层分离法5.5疏水作用层析（HIC）5.6金属螯合层析5.7共价作用层析法5.8离子交换层析法5.9卡那霉素A、B组分分离纯化典型实例吸附色层与其他色层分离法的异同点吸附层析化学、物理吸附操作简便易受离子干扰各种生物大分子的分离、脱色、和去热源凝胶层析分子筛的排阻效应分辨力高，不会引起变性各种凝胶介质昂贵，处理量有限制分子量有明显差别的可溶性生物大分子分配层析溶质在固定相和流动相中分配系数的差异分辨力高，重复性较好，能分离微量物质影响因子多，上样量太小用于各种生物大分子的分析鉴定亲和层析亲和层析生物大分子与配体之间有特殊亲和力分辨力很高一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大各种生物大分子聚焦层析等电点和离子交换作用分辨力高进口试制昂贵蛋白质和酶吸附层析的分类无机材料的吸附色层分离法离子交换色层分离法疏水作用色层分离法共价作用色层分离法金属螯合作用色层分离法等作业名词解释：梯度洗脱法、共价作用层析、免疫亲和层析、层析剂的排阻效应、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤：2.填空：1)凝胶过滤主要应用于＿＿＿＿＿＿＿，＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿。凝胶过滤时＿＿＿＿＿＿先自柱中流出，凝胶电泳中＿＿＿＿＿运动速度更快，凝胶电泳是基于＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿双重机理，常用的凝胶剂有＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿。2)共价作用层析主要依靠＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的原理，吸附层析是基于＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的机理，蛋白质和离子交换剂的结合是通过＿＿＿＿＿＿＿＿＿而结合，离子交换层析剂有＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿sephadexG-15表示＿＿＿＿＿＿，硅胶G不能用＿＿＿＿＿显色剂检测，硅胶GH254可用于分离＿＿＿＿＿＿而无需显色处理。3.是非判断题：请对以下论述进行是非判断，对的打√，错的打×，并予以改正。1)凝胶电泳和凝胶过滤的机理是一样的。2)sephadexG-15表示水滞留量为1.5克/克干胶。3)硅胶G能用浓硫酸显色剂检测。4)凝胶过滤常用的凝胶剂有葡聚糖和琼脂糖两种。5)梯度洗脱法能减轻层析时的脱尾现象。