布病检测方法及质量控制

布病检测方法及质量控制一、布病诊断•布病的诊断过程可分为初步诊断和实验室诊断。•初步诊断实验室诊断流行病学调查临床诊断病理诊断病原学血清学（一）初步诊断1流行病学调查（1）疫区内动物基本情况，免疫情况，免疫监测情况等。（2）本次疫病的流行情况，包括最初发病时间，地点，疫情，是否在短时间内出现许多明显的流产症状。本地区过去曾否出现过布病，附近地区近期是否有布病发生，是否有其它地方引进动物或有其它地方人员来参观。（3）本地相关动物管理制度，牲畜流动，检疫屠宰情况，气候、地理、交通情况等。2临床诊断（1）最初阶段的临床症状不明显。（2）随着病程的发展，布病会引起母畜流产、死胎、不孕和子宫内膜炎等。（3）雄性动物出现附睾炎和睾丸炎。3病理学诊断（1）胎衣呈黄色胶东样浸润，有些部位覆有纤维蛋白絮片，有出血点。（2）胎儿胃中有淡黄色或白色黏液絮状物，肠胃和膀胱的浆膜下可见有点状或线状出血。（3）皮下呈出血性浆液性浸润。（4）淋巴，脾脏和肝脏有不同程度肿胀。（5）期待呈浆液性浸润，肥厚。可能有肺炎病灶。（二）实验室诊断实验诊断主要是运用实验技术和方法，通过感官、试剂反应、仪器分析和动物实验等手段进行的诊断。布病的实验室诊断包括病原学，血清学诊断。1病原学诊断属种型布鲁氏菌与否？牛、羊、猪种布鲁氏菌？变型1,2,3……（1）病原分离鉴定将病料中（组织或奶样）的病原进行分离培养，并对其属、种、型进行分析。从而判定该疑似病原是否属于布鲁氏菌属，属于布鲁氏菌属的那个种（流产，猪，羊等），属于该种布鲁氏菌的哪个变型。优点：①诊断结果明确，是布病诊断的“金标准”。②能对流行菌株进行分型，流行病学价值高。缺点：①费时检测需要花费近一周的时间，不适用于大规模的检测。②费钱需要高级别的生物安全实验室及生物安全管理体系，适当的培养基，这些都需要花费大量的财力。③不敏感，不易采样。（2）PCR随着分子生物学的发展，PCR等技术得到广泛应用。我们实验室使用的主要是多重PCR技术，来对布鲁氏菌的种型进行分析。其扩增的目的条带是细菌基因组中广泛分布的基因片段。通过电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异。该方法特异性强，灵敏度高，简单快捷。引物名称a序列（5’—3’）扩增产物大小（bp）BMEI0998fBMEI0997rATC—CTA—TTG—CCC—CGA—TAA—GGGCT—TCG—CAT—TTT—CAC—TGT—AGC1682BMEII0843fBMEII0844rTTT—ACA—CAG—GCA—ATC—CAG—CAGCG—TCC—AGT—TGT—TGT—TGA—TG1071BMEI1436fBMEI1435rACG—CAG—ACG—ACC—TTC—GGT—ATTTT—ATC—CAT—CGC—CCT—GTC—AC794BR0953fBR0953rGGA—ACA—CTA—CGC—CAC—CTT—GTGAT—GGA—GCA—AAC—GCT—GAA—G272BMEII0987fBMEII0987rCGC—AGA—CAG—TGA—CCA—TCA—AAGTA—TTC—AGC—CCC—CGT—TAC—CT152引物如下:反应条件如下：95℃7min预变性；然后进行25个循环的扩增（95℃35s，64℃45s，72℃3min），最后72℃延伸10min，4℃保存。结果判定：①电泳同时出现152bp、794bp和1682bp3条条带，为牛种布鲁氏菌；②电泳同时出现152bp、794bp、1071bp和1682bp4条条带，为羊种布鲁氏菌；③电泳同时出现152bp、794bp和1071bp3条条带，为绵羊附睾种布鲁氏菌；④电泳同时出现152bp、272bp、774bp、1071bp和1682bp5条条带，为猪种布鲁氏菌；⑤电泳同时出现152bp、272bp、1071bp和1682bp4条条带，为犬种布鲁氏菌；⑥电泳同时出现272bp、794bp、1071bp和1682bp4条条带，为沙林鼠种布鲁氏菌。2血清学诊断RBT（虎红平板凝集实验）SAT（试管凝集实验）CFT（补体结合实验）ELISA（酶联联免疫吸附实验）FPA（荧光偏振实验）布鲁氏菌诱导机体抗体曲线图2.1RBT简便快捷，敏感性较高。能够检测所有光滑型布鲁氏菌的感染。抑制IgM,检测IgG1。等体积混合4分钟，观察到凝集现象。会产生假阳性与假阴性。（1）技术要点：①反应条件要控制在室温，3D摇晃4min后立即判读（大量样品操作时容易造成时间延误）。②虎红抗原要4°C冷藏，严禁冷冻保存。③不能使用血浆样本（容易产生假阳性）。④在实验过程中要加阴阳性对照。（2）RBT抗原质量控制如果想得到更为可靠、准确使检测结果，就要对检测的各个环节进行质量控制，使其标准化。首先要对抗原进行质控。（3）RBT抗原质控的方法①当新的一批抗原到来时，要对新的抗原进行质控。简述RBT抗原质控方法如下（以OIE标准血清为例）：②抗原滴度（可检测性）：将OIEISS标准血清用生理盐水稀释为1：25,1：40,1：45,1：55和1：100。RBT实验中当血清在1:45稀释度时检测为阳性，1:55为检测阴性则此项合格。如果超过了这个范围则检测度不合格。③敏感性：取滴度略高于阴阳性临界值的阳性血清，并用待检抗原检测，当检测结果均为阳性时则此项合格④特异性：对阴性血清（通过未感然布鲁氏菌动物的血液制备）进行检测，检测结果全为阴性则此项合格。⑤纯度/无菌性通过以上标准对抗原进行质控至关重要。因为如果没有良好质控的话，则实验中虎红抗原可能会过于敏感（产生许多假阳性），或敏感性不够（产生许多假阴性）。当没有OIE标准血清时，需要使用国家标准血清对抗原进行质控。国家标准血清符合OIE的要求，应由国家参考实验室提供。2.2SAT•特异性抗体可与相应的布氏菌抗原发生特异性结合，在电解质的作用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，通过这种检测来判断，该动物是否为患病动物。优点：①SAT主要检查血清中的IgG和IgM。②特异较好，实用性、敏感性较强。缺点：①有前带现象，有时出现假阴性结果。②出结果慢，需要两天。实验要点：①受检血清应新鲜、无溶血、无污染。②存放血清处温度不能超过10℃，采血后应于3-4日内进行检查，因放置时间过长可能会导致血清效价降低。③个别血清会出现前带现象，建议多做几个管，多采用几个稀释度。2.3iELISA间接酶联免疫吸附试验（iELISA）是另一种对布病抗体敏感性较高的实验。大概步骤如下，抗原包被在平板上，血清或奶样中的特异性抗体能够与抗原形成复合物。通过洗液洗涤去除未结合的抗体，当用酶标二抗孵育显色以后，可以通过index值来判断动物是否为阳性。（1）实验要点：①要严格控制孵育时间和实验温度。②洗涤步骤是最为关键的。要充分洗涤，拍干残留液体，不要让板子变干燥。③奶样要-20°C冻存，在4°C保存抗体滴度会降低。④实验过程中，要加入阴阳性对照。（2）新进iELISA试剂盒的质控：①对不同检测样品都要进行一次质控（血清，奶）包括以下几个方面：②可检测性（OIE标准血清为例）：OIEELISAspISS1:16稀释为阳性，1:64稀释时为阴性。③敏感性同RBT④特异性同RBT⑤可重复性（每种样品要经过多次重复（20次）并且在两块板子上进行检测，来观察产品的重复性是否良好）。2.4CFT补体结合实验（CFT），是利用绵羊红细胞与溶血素，补体组成溶血指示系统。当布鲁氏菌的特异性抗原、抗体复合物竞争结合指示系统中的补体时，溶血被抑制。因此可以通过抗溶血的程度来判断抗体滴度与阴阳性。补体结合实验主要检查IgG类抗体，特异性强，准确性高，敏感性差，但是操作比较复杂，可以作为确诊检测。在过去的实验中主要通过凝集管进行检测，费时费力废材料。在接受ANSES培训以后，我们开始做微量CFT，用96孔板进行CFT实验，大大地提高了检测效率。（1）CFT实验步骤比较繁琐，要注意以下的事项：①采血5天后方能使用（让红细胞静息）。②每批溶血素需要测一次效价，每次实验前要测补体效价。③使用与测定补体效价同一批的红细胞，溶血素来做主体实验。④待检血清需灭活。⑤加入对照（+，-,Ag,C,SRBCs）。（2）CFT抗原质控质控方法与RBT抗原相似①可检测性（OIE标准血清为例）：CFT抗抗原的质控标准为，OIE标准血清200倍稀释时产生50%的溶血抑制现象。②敏感性同RBT③特异性同RBT④可重复性2.5FPA荧光偏振免疫分析法(fluorescencepolarizationimmunoassay，FPA)是一种定量免疫分析技术荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受激发时转动的速度呈反相关（如图）。所以利用荧光素标记布鲁氏菌的抗原，当抗体与抗原形成复合物以后，转动速度变慢，荧光强度增强。阳性阴性形成大的免疫复合物未形成复合物，旋转速度变慢旋转加快形成偏振光不形成偏振光2.6血清学方法选择的原则一般来说检测方法的敏感性和特异性不可兼得，当敏感性提高时，特异性就会降低，当特异性提高时，敏感性会降低。因此在血清学检测时，可以根据实际情况来选择检测方法。可以通过敏感性较高又具备一定特异性的方法对样品进行初筛，然后通过特异性较高的方法进行确诊。从上图中可以看出FPA、RBT、iELISA的敏感性较高，适合用作初筛实验。而CFT、cELISA、SAT的敏感性不是很高但是特异性较强所以适合用作确诊方法。综上我们推荐使用以下检测方法组合。初筛：选择RBT，因为它具有以下的特点：方便，便宜，敏感性强又兼具有一定的特异性。但是它对疫苗诱导抗体敏感。确诊：SAT（OIE不推荐），CFT（便宜，特异性强，对疫苗诱导产生的抗体不是很敏感）。2.7其它方面的实验室质量控制（1）实验室资源的质控：①人员：要求人员充足，通过能力认证并可追溯，业务熟练（经过内部或外部培训），分工明确。②仪器：经过认证，校准，并且有定时检查维护。如冰箱，生物安全柜，恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，移液器等。以移液器为例，需要按时对移液器进行校准。精确度低精确度高精准度高精准度低③检测步骤：要有标准化的实验步骤，实验条件，并编辑成册。④记录检测试剂信息：要及时记录各种检测试剂的信息（批号，生产日期等）。⑤检测结果记录，验证：要在实验过程中对实验结果进行记录，需要第二个人对实验结果进行验证。⑥表格：各种表格要完备，并要放在触手可及的地方。（3）实验室外部质控环比实验：外部的质量体系对实验室进行的能力验证。在环比实验中，实验室会收到15-20个盲样，这些盲样的滴度都已经被测定，并且都通过了稳定性与均一性实验。通过环比实验，可以评判各实验室在检测过程中所存在的问题，以便其不断改进。中国动物卫生与流行病学中心，人兽共患病监测室在2015年11月29日进行了第一次环比实验，现结果正在汇总分析当中。2015年环比实验样品制备谢谢大家！！！