基因工程实验报告

基因工程实验报告姓名：杜琳颖学号：2017051141学院：生命科学院专业：生化与分子一、实验目的学习并掌握从目的基因克隆到蛋白质表达的实验流程及原理。二、实验流程实验一、质粒提取载体DNA提取及酶切鉴定一、实验目的学习质粒的酶切及电泳分析。二、实验原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。三、实验材料、仪器及试剂（一）实验材料含载体质粒pET28a的大肠杆菌（二）试剂1、LB液体培养基2、质粒提取试剂盒(天根生物科技)3、TBE缓冲液4、点样缓冲液Loadingbuffer（10×）5、琼脂糖6、NcoⅠ酶，XhoⅠ酶(Takara)7、DNA回收纯化试剂盒（天根生物科技）（三）仪器1、Eppendorf管、离心管架2、10，50，200，1000μL微量加样器3、Eppendorf台式高速离心机4、电泳仪系统5、恒温水浴箱6、凝胶成像仪7、摇床等四、实验步骤（一）质粒提取1、柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2、取1.5mL过夜培养的菌液（已备好），加入1.5mL离心管中，使用12,000rpm离心1min，尽量吸除上清，再收集一次菌体（根据浓度选择）。3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。4、向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。5、向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。6、将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7、向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。重复漂洗一次。8、将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。9、将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。（二）琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA吸取4μL所提质粒，加入2μLloadingbuffer混匀后点样至0.8%琼脂糖凝胶中，电泳20min左右后拿出放入凝胶成像系统，根据图像判断所提质粒浓度及质量。（三）质粒载体DNA酶切1、按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中。2、加样后混匀，置于37℃水浴中，保温5h。3、吸出8μL酶切产物，加入2μLloadingbuffer混匀后点样琼脂糖凝胶电泳，鉴定酶切是否正确，两个酶切位点之间片段大约150bp左右，理论上双酶切电泳应出现两条带，一条较亮的长片段和一条很暗的小片段。而单酶切只出现一条带，即线性化载体。同时应点样质粒作为阳性对照。4、确认酶切正确后，在酶切产物中加入loadingbuffer终止反应，准备胶回收。（四）载体片段的获得1、取酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测确认酶切完全后，然后进行载体片段的回收。2、制备胶回收的琼脂糖凝胶。3、将双酶切样品加入点样空中，进行电泳分离。4、将凝胶板染色后，在凝胶成像仪中切取DNA大片段。5、柱平衡步骤：向吸附柱CB2中加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。6、将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。7、向胶块中加入等倍体积溶胶PC，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。8、将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。9、向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。重复漂洗一次。10、将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。11、将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加35μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm离心2min，收集DNA溶液，此就为连接所用载体Vector。五、实验结果及分析1.质粒提取检测结果由此结果可知，质粒提取的质量比较好，且浓度也比较高。可以作为下一步酶切的模板。2.载体双酶切结果由于未点样质粒对照，且单酶切条带离双酶切较远，不好比较，故此次结果不能充分说明载体切开。但从图上来看，11,12,13,14泳道很可能是未切开的载体，而1,2,3,4,5,6,7,8泳道的产物与其相比可判断为已切开的载体。此外，此图上未能看到两个酶切位点间的大约150bp左右的小片段，可能是浓度太低亮度不够，也可能是由于片段太小已跑出凝胶。所以，先将1-8泳道的酶切产物胶回收，拟与回收的目的基因连接转化，通过后来的菌落PCR鉴定是否正确。另外，此次试验酶切做了两次，第一次结果如下图：很明显看出有三条带，同样，由于没有质粒对照，不好说明最上面是切开的还是未切开的载体，但通过底下两条带可以推断出，此质粒可能有问题。其载体上两个酶切位点有可能并非一个，除了我们预计的那两个，可能序列中还存在同样的酶切位点，所以导致酶切产物出现多条带的现象。故更换实验材料重新提取质粒和做双酶切。实验二、目的基因的获得及酶切处理一、实验目的1、学习PCR反应的基本原理和实验技术。2、了解引物设计的一般要求。3、掌握PCR产物的回收及酶切过程二、实验原理聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。PCR进行的基本条件：⑴DNA模板⑵引物⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）⑷TaqDNA聚合酶⑸反应缓冲体系PCR循环由三个步骤组成：⑴变性使模板DNA解离成单链；⑵退火使引物与模板DNA所需扩增序列结合；⑶延伸DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。三、实验仪器及试剂（一）仪器PremixEXTaqDNA聚合酶10×反应缓冲液（含25mmolMgCl2）引物F1:5'-CATGCCATGGGCGAGGGCAAAGCCCGCAC-3’；R1:5'-CCGCTCGAGTCAGACATAAGAAAAGCCATTGG-3’NcoⅠ酶，XhoⅠ酶(Takara)胶回收试剂盒（天根生物科技）DNA模板（二）试剂PCR扩增仪等四、实验步骤（一）PCR扩增1、按下表加入试剂，并小心混匀。2、设置PCR程序并运行：（二）PCR产物鉴定反应结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖电泳分析。（三）目的基因片段的回收步骤同载体片段回收。（四）目的基因片段的酶切加样后混匀，置于37℃水浴中，保温7~12小时。然后每个管中加入Loadingbuffer终止反应。（五）目的基因片段酶切后回收同载体片段回收的步骤进行。此为Insert，为连接做好准备。五、实验结果及分析1.目的基因的获得目的基因为VP60，是兔出血热病毒外壳蛋白，目的片段大约1700bp左右，点样所用的Marker为DL2000。从图上看出，PCR产物大小位于2000偏下一些，大致与目的基因大小一致。可以说明目的基因获得正确。由于引物设计加了酶切位点，所以该产物序列两端带有两个酶切位点，便于下一步酶切回收后与载体连接转化。实验三、质粒载体和外源DNA的连接及转化一、实验目的1、掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。2、掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。二、实验原理DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’-5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。进行连接反应时，为了减少片段的自连，通常要进行去磷酸化，去磷酸化可通过碱性磷酸酶完成。比如将目的片段和载体进行时通常要将载体去磷酸化，以减少载体的自连。同要进行连接反应也经常对目的片段进行磷酸化以增强目的片段的连接，在相邻碱基间如果没有磷酸在连接效率大幅下将，如果载体进行了去磷酸化，目的片段可进行磷酸化，以增强目的片段和载体的连接。在连接反应中，目的DNA片段和载体的比例是一个关键问题，对于长度为1kb的片段和3kb的载体而言，通常目的片段和载体的比例设为2：1或3：1，如果目的片段越长该比例应再升高，因为主要考虑的是载体和目的片段之间的分子数的比例。反应体系中核酸的浓度也是一个重要问题，通常反应体系中反应物浓度应保持在25--100ng/μL。连接反应和其它酶不同，需要在较低的温度下进行，通常在12～16℃过夜，也可在4℃过夜连接，如果是平末端连接，可适当提高连接温度。除上述因素外，DNA样品的纯度、盐浓度等会影响连接效率。所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。通常用0.1MCaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。将重组DNA导入细胞的方法有多种，如热休克法，电击法等。通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。三、实验材料、仪器及仪器（一）材料大肠杆菌DH5α菌株（二）仪器1、冷冻离心机2、恒温水浴3、微量移液器4、无菌操作台5、电子天平（三）试剂1、目的DNA片段(NcoⅠ/XhoⅠ)2、载体（pET-28aNcoⅠ/XhoⅠ）3、T4DNA连接酶（T