PCR的经验与教训

PCR的经验总结——中心实验室•内容提要：•PCR的简介•PCR的原理•PCR的操作步骤•PCR的结果分析•相关PCR技术简介•PCR的简介：1983年KaryMullis发明1985年开始有文章发表1993年获诺贝尔奖广泛用于分子生物学领域•PCR的简介：聚合酶链式反应，简称PCR（PolymeraseChainReaction），指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。•PCR的原理：•PCR的操作步骤•标准的PCR反应体系•10×扩增缓冲液10μl•4种dNTP混合物各200μmol/L•引物10～100pmol•模板DNA0.1～2μg•TaqDNA聚合酶2.5u•Mg2+1.5mmol/L•加双或三蒸水至100μl•PCR的反应流程：•温度与时间的设置：•变性温度与时间：一般93℃～95℃，1min足以使模板变性，若低于93℃则需延长时间，但温度过高对酶的活性有影响。引物10～100pmol•退火(复性)温度与时间：取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想。•按下公式计算：Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值－（5～10℃）•在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。一般为30～60s。•延伸温度与时间：•A.延伸温度：一般选在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min；3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增，但是对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。•B.循环次数：循环次数决定PCR扩增程度，主要取决于模板DNA的浓度，一般选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。•PCR的结果分析目的基因starPCR扩增产物的片段长度大小为187bp,电泳的条带也在187bp左右，表明扩增产物是我们的目的条带，并且没有非特异性条带，无引物二聚体。•PCR常见问题与对策PCR反应的关键环节有：①模板核酸的制备②引物的质量与特异性③酶的质量及纯度④PCR循环条件寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。•问题一：酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。Mg2+浓度:Mg2+浓度过低影响PCR扩增产量甚至PCR扩增失败而不出扩增条带变性：退火温度太高，延伸时间太短靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。•问题二：无扩增产物现象：对照有条带，而样品无原因:1、模板:含有抑制物，含量低2、Buffer对样品不合适3、引物设计不当或者发生降解4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2、更换Buffer或调整浓度3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4、降低退火温度、延长延伸时间•问题三：PCR产物量过少现象：有条带，但产物量过少原因:1、退火温度不合适2,、DNA模板量太少3、PCR循环数不足。4、引物量不足5、延伸时间太短6、DNA模板中存在抑制剂对策：1、以2℃为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度2、增加DNA模板量3、增加反应循环数4、增加体系中引物含量5、以1kb/分钟的原则设置延伸时间6、确保DNA模板干净•问题四：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1、引物特异性差2、模板或引物浓度过高3、酶量过多4、Mg2+浓度偏高5、退火温度偏低6、循环次数过多对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR2、适当降低模板或引物浓度3、适当减少酶量4、降低镁离子浓度5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法6、减少循环次数阳性对照marker•问题五：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态原因：1、模板不纯2、Buffer不合适3、退火温度偏低4、酶量过多5、dNTP、Mg2+浓度偏高6、循环次数过多对策：1、纯化模板2、更换Buffer3、适当提高退火温度4、适量用酶5、适当降低dNTP和镁离子的浓度6、减少循环次数•问题六：杂带现象：扩增产物出现多条带原因：1、引物用量偏大或引物的特异性不高2、模板量过多3、酶的用量偏高或酶的质量不好4、退火温度偏低，退火及延伸时间偏长5、外源DNA污染对策：1、应降低引物的使用量或调换引物2、质粒DNA的用量应50ng，而基因组DNA则应200ng3、应降低酶量或调换另一来源的酶4、应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。5、确保操作的洁净•问题七：扩增产物在凝胶呈弥散状现象：扩增产物在凝胶呈弥散状原因：1、酶量过高或酶的质量差2、dNTP浓度过高3、模板量过多4、引物浓度不够优化5、循环次数过多对策：1、减少酶量或调换另一来源的酶2、减少dNTP的浓度3、质粒DNA的用量应50ng，而基因组DNA则应200ng4、对引物进行梯度稀释重复PCR反应5、减少循环次数•问题八：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。•相关PCR技术逆转录PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆转录而来的DNA为模板，由此产生出来的---DNA不带有内含子，常应用于分子克隆技术。-荧光定量PCR（qRT-PCR）：PCR过程中利用荧光探针或染料定量检测，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法•RT-PCRTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTReverseTranscriptionmRNAAAAAAAAAAAAAADNA水平RNA水平基因cDNAmRNAmRNA•RT-PCR一般步骤：RNA提取（-70℃保存）1、组织剪碎加入1mlTrizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）2、转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min3、加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min4、10000rpm4℃离心15min5、转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min，12000rpm4℃离心15min6、倒掉上清，加1ml75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，10000rpm4℃离心5min7、倒掉上清，室温或37℃放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥8、加20ulDEPC水至EP管中9、在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解•测RNA浓度·调零：750ulDEPC水·测量：745ulDEPC水+5ulRNA·总RNA浓度=OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml=OD260×40×150ug/ml=OD260×6ug/ul·A1/A2应在1.8-2.0之间反转录：在微量离心管中加入模板RNA2ug，Olig(dT)18(0.1ug/ul)5ul，10mmol/LdNTP2ul，DEPC水补足体积至14ul，65℃水浴5min，立即放到冰上，顺序依次如下：5*M-MLV反应缓冲液4ul核酸酶抑制剂（25U/ul）1ulM-MLV反转录酶（100U/ul）1ul37℃孵育60minPCR反应：反转录产物（模板）2ul10*PCR反应缓冲液5ul10mmol/LdNTP4ul引物（50umol/L）1ulTaq酶（50U/ul）0.5ulDEPC水37.5u•设置扩增程序：94℃5min热启动，94℃45s，57℃30s，72℃1min，72℃10min30cycle•qRT-PCR·TaqMan法·SYBRGreen1法•TaqMan法•TaqMan法反应体系：总RNA根据实验qPCRmix（包含MLV、Hot-startTaq、dNTP等）终浓度为1×TaqmanProbe根据实验上游引物，10μM终浓度：~200nM下游引物，10μM终浓度：~200nMMgCl2根据实验RNase-FreeH2OTo25.0μl•设置程序：PCR反应条件如下：步骤循环数步骤温度时间逆转录1142℃30min失活MLV，激活Taq实时荧光定量PCR1195℃10min40195℃15sec260℃1min•SYBRGreen1法●SYBRGreen1是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。●SYBRGreen1只与DNA双链结合才能发出荧光。●荧光信号强弱与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加未结合SYBRGreen1染料•SYBRGreen法反应体系：总RNA根据实验qPCRmix（包含MLV、Hot-startTaq、dNTP等）终浓度为1×SYBRGreenIsolution终浓度为1×上游引物，10μM终浓度：~200nM下游引物，10μM终浓度：~200nMMgCl2根据实验RNase-FreeH2OTo25.0μl•设置程序：PCR反应条件如下：步骤循环数步骤温度时间逆转录1142℃30min失活MLV，激活Taq实时荧光定量PCR2X℃30sec40372℃30sec1195℃10min195℃15sec•TaqMan法与SYBRGreen1法的比较•定量与普通PCR的差别•PCR的小技巧•模板：纯度要高，完整性要好，浓度要适当•引物：一次多设计几组，同时PCR；拿到的引物一般是干粉，尽量用其中一管，避免反复冻融；前期引物设计多花心思，提高引物质量•聚合酶：有条件者全程用Pfu高保真酶，防止突变；严格放置冰盒，防止失活•操作细节：全程严格无菌；所有东西现配现用；动作轻柔；有针对性地做温度梯度、引物梯度、模板浓度梯度•实验室现有的PCR仪细节决定成败公用平台的维护，人人有责谢谢大家！