MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项

MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项一、MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-2)-3,5-diphenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，须被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。二、MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/mL。因此，可以称取MTT0.5g，溶于100mL的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/mL保存在-20ºC长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往细胞培养板中加，没必要一下子配置那么多液体，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好使用透明的一次性乳胶手套.配成的MTT需要无菌环境，MTT对微生物很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用PBS（pH=7.4）溶解。PBS配方：Nacl8g＋Kcl0.2g＋Na2HPO41.44g＋KH2PO40.24g调pH为7.4,定容1.0L。三、普通MTT法实验步骤：1：接种细胞。用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200uL。2：培养细胞。同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3：呈色。培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/mL用PBS配制，pH=7.4)20uL.继续孵育4h，终止培养，小心移除孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150uLDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。4：比色。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。四、药物MTT法实验步骤：A：贴壁细胞：1：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100uL,铺板使待测细胞调密度1000-10000孔（边缘孔用无菌PBS填充）。2：5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度,每孔100uL,设3-5个复孔。建议设5个，否则难以反应真实情况。3：5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4：每孔加入20uLMTT溶液（5mg/mL，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5：终止培养，小心吸去孔内培养液。6：每孔加入150uL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD=490nm处测量各孔的吸光值。7：同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。B：悬浮细胞：1：收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40uL；②加ActinomycinD（有毒性）10uL用培养液稀释(储存液100mg/mL，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10uL；④细胞悬液50uL（即5×104cell/孔），共100uL加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100mL1640培养基）。2：置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3：每孔加入10uLMTT溶液（5mg/mL，即0.5%MTT），继续培养4h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD=570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）。4：离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100uL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD=570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。5：同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。五、注意事项：(1)选择适当得细胞接种浓度。(2)避免血清干扰。一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。(3)设空白对照。与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。(4)MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。(5)用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200uL1640培养基，20uLMTT，150uLDMSO加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定。(6)一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/mL，MTT加20uL，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150uLDMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。