梨NAC结构域蛋白基因克隆与mRNA嫁接传递性研究

中国农业科学2010,43(11):2307-2314ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2010.11.014收稿日期：2010-02-04；接受日期：2010-03-26基金项目：国家自然科学基金项目（30871697）、北京市自然科学基金项目（6102017）、中国农业大学基本科研业务费研究生科研创新专项作者简介：宫磊，硕士研究生。E-mail：[e-mail]。通信作者李天忠，教授，博士。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]梨NAC结构域蛋白基因克隆与mRNA嫁接传递性研究宫磊，张文娜，徐海燕，杨玉艳，胡建芳，李天忠（中国农业大学农学与生物技术学院果树细胞与分子育种实验室，北京100193）摘要：【目的】克隆梨NAC结构域蛋白基因NACP，验证其mRNA是否可以通过韧皮部进行嫁接传递。【方法】利用同源克隆的方法，分别克隆‘鸭梨’（PyrusbretschneideriYali)和杜梨（PyrusbetulaefoliaBunge）的NACP基因，利用生物信息学方法进行序列分析。以‘鸭梨’为接穗，杜梨为砧木进行微嫁接。从接穗茎尖、叶片、茎段韧皮部，嫁接口及砧木韧皮部、木质部组织中提取RNA，进行RT-PCR扩增。用特异的限制性内切酶ScrFⅠ对其扩增产物进行酶切鉴定。利用原位杂交技术，检测NACP基因在植物体内的表达部位。【结果】获得‘鸭梨’和杜梨NACP基因全长序列，长度均为1377bp，编码350个氨基酸，包含两个内含子，大小分别为111、96bp，分别命名为YL-NACP和DL-NACP。酶切鉴定结果表明，在接穗‘鸭梨’茎尖、叶片、茎段韧皮部中都有砧木DL-NACP基因的mRNA表达，同时砧木杜梨韧皮部中也有接穗YL-NACP基因的mRNA表达，而木质部中则没有发现该基因表达。通过原位杂交进一步证明，NACP基因只定位于韧皮部。【结论】成功地从‘鸭梨’和杜梨中克隆了全长的NAC结构域蛋白基因NACP，并进一步证明了梨内源性的NACP基因mRNA可以通过韧皮部进行传递，该结果为进一步研究果树砧木与接穗的互作机制奠定了基础。关键词：梨；NACP基因；mRNA；嫁接；分子传递MolecularCloningoftheNACDomainProteinofPearandResearchonItsmRNATransportinPhloemGONGLei,ZHANGWen-na,XUHai-yan,YANGYu-yan,HUJian-fang,LITian-zhong(LaboratoryofFruitCellandMolecularBreeding,CollegeofAgricultureandBiotechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193)Abstract:【Objective】Theaimofthisresearchistoclonethefull-lengthDNAsequencesencodingNACdomainproteininpear,andtofindoutwhetherthelong-distancemovementoftheNACPmRNAviathephloem.【Method】Thefull-lengthsequencesencodingNACdomainproteinwereisolatedfromPyrusbretschneideriYaliandPyrusbetulaefoliaBungebythehomologycloningmethod.Bioinformaticsmethodswereusedforsequenceanalysis.HeterograftexperimentswereperformedbyusingPyrusbetulaefoliaBungeastherootstockandPyrusbretschneideriYaliasthescion.Samplesweretakenfromtheoutertissueofscionandrootstock,wherethephloemcellslie,inadditiontotheshootapexandleafofthescion.TheamplifiedproductsweredigestedbythespecificrestrictionenzymeScrFⅠ.ToidentifythepreciselocationofNACPtranscripts,insituhybridizationstudieswereconductedonthetransversesectionsofrootstock.Dl-NACPmRNAwasdetectedinthephloembyantisenseprobe.【Result】Thefull-lengthofNACPconsistedof1377bpencoding350aminoacids.Theycontainedtwointronswhosesizewas111bpand96bp,respectively.RestrictionenzymedigestionresultsshowedthattherewerethestockNACPgeneexpressionsinapex,leaf,stemphloemofthescion,whiletherewasthescionNACPgeneexpressioninthestockphloem,butnotinthexylem.【Conclusion】AlloftheresultsindicatethattheobtainedgenesarethenewmembersoftheNACdomainproteingenefamily.TheconceptthattheendogenousRNAmoleculescirculatethroughouttheplantviathephloemprovedtobecorrect.Theresultshavelaidafoundationforstudyofthemechanismofrootstockandscioninteractions.Keywords:pear;NACdomainprotein;mRNA;graft;moleculartransport2308中国农业科学43卷0引言【研究意义】在果树生产过程中已广泛应用嫁接来进行品种更换、获得抗性及矮化等有利于生产的优良性状。相同接穗嫁接至不同砧木后，其表型、生理生化特性及基因表达[1-2]都有所改变，其中许多特性与果实性状、花期早晚有关，对果树生产具有一定的影响。笔者在梨中初步验证内源性NACP基因mRNA分子可以在植物体内进行传递，为今后对mRNA传递机理的深入研究奠定基础。同时可以进一步揭示砧穗互作机制，在生产上有目标的改良果树砧木，进而达到调控接穗获得某些优良性状的目的。【前人研究进展】目前对于砧穗互作机理的研究仍然不是很清楚，大多认为嫁接结合部控制激素的流通、同化物的运输和水分、养分的吸收[3]。迄今已在蓖麻[4]、拟南芥[5]、大麦[6]、甜瓜[7]等植物的韧皮部汁液中发现数百种mRNA。通过一系列的研究证明，非细胞自治的mRNA不仅可以通过嫁接口，而且可能是作为长距离信号分子在植物的生理和发育转变方面发挥关键作用[8-9]。NAC结构域蛋白是一种转录调控因子。植物特异性NAC结构域基因的特点是高度保守的N端区域和高度多态性的C-末端。保守的N端可能作为NAC的DNA结合区域[10]，而C端则可能作为转录激活区域[11-14]。NAC结构域蛋白参与植物的许多发育过程[15]。例如，有助于胚胎模式形成[16]，叶片衰老[17]，花发育[18]，侧根形成、发育[11,19]和次生壁加厚[20]。NAC结构域蛋白也被证明参与植物非生物胁迫和防御反应[21-24]。从南瓜属（南瓜）的韧皮部汁液中分离出来一个编码NAC的转录调控因子CmNACP的mRNA。表达分析和嫁接试验证明CmNACP基因mRNA可以通过韧皮部进行长距离运输，并在营养器官、根和花分生组织中积累[25]。【本研究切入点】mRNA分子通过韧皮部传递并影响植物生长发育方面的研究报导较少。对此领域的研究不仅可以全面揭示砧穗间分子传递机制，同时可以通过其传递载体作用携带不能传递的性状决定子基因长距离运输，实现定点改良砧木，达到调控接穗某些性状的目的。【拟解决的关键问题】克隆‘鸭梨’和杜梨中全长的NAC结构域蛋白基因NACP，并进一步证明梨内源性的NACP基因mRNA可以通过韧皮部进行传递。1材料与方法1.1植物材料与微嫁接1.1.1植物材料选取杜梨（PyrusbetulaefoliaBunge）和‘鸭梨’（PyrusbretschneideriYali）组培苗幼叶，液氮处理后-80℃冰箱保存用于基因克隆。1.1.2微嫁接在无菌条件下，将扩繁30d后的杜梨组培苗去头，留约1.5cm长茎段，沿顶部纵切；取苗高1cm的‘鸭梨’组培苗，顶端留2—3片叶，基部削成“V”型，插入砧木切口，用锡箔纸固定，嫁接苗在培养基MS+0.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IBA中生长。1.2NACP基因克隆与序列分析1.2.1DNA提取采用CTAB法[26]进行基因组总DNA的提取，用1%琼脂糖凝胶进行检测，-20℃冻存。1.2.2编码NAC蛋白基因扩增与序列分析根据GenBank中公布的拟南芥、南瓜、苹果‘富士’等植物NACP基因序列设计引物，上游引物：5′-TGATTTCCCGAATTTAGAGC-3′，下游引物：5′-GAGATCAATAATTCCAGAGGC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。以‘鸭梨’和杜梨DNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性，3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环,延伸72℃6min，4℃保存。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，随后利用中科瑞泰琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收。PCR产物经回收后，连接到pMD18-T载体上，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选后，挑取白斑摇菌进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的菌液送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。将获得的基因序列在NCBI（）中进行BLAST分析，用DNAMAN进行核苷酸及氨基酸序列的同源性比较、分析并绘制进化树。1.3NAC结构域蛋白基因微嫁接组织RT-PCR扩增与酶切鉴定1.3.1植物材料RNA的提取植物材料RNA的提取采用CTAB法[26]，微嫁接后1、2、3、4、5和10d，分别从同一时期各嫁接植株的接穗‘鸭梨’茎尖、叶片、茎段韧皮部，嫁接口和砧木杜梨茎段韧皮部、木质部中取样，提取总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测后置-80℃冰箱保存备用。1.3.2鉴定引物的筛选与RNA分子传递分析采用酶切鉴定的方法验证NACP基因mRNA的传递。利用DNAMAN与Primer5.0确定‘鸭梨’与杜梨核苷酸序列的酶切位点。通过对两个基因酶切位点的分析，筛选出一个特异的限制性内切酶ScrFⅠ，在其11期宫磊等：梨NAC结构域蛋白基因克隆与mRNA嫁接传递性研究2309酶切位点上下游设计1对引物，上游引物：5′-AAGCCACAGGCAAAGATAAG-3′，下游引物：5′-CCAGAGGCAATCGAATTCT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。筛选引物时分别以‘鸭梨’和杜梨cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物回收、纯化后进行酶切。筛选出的鉴定引物PCR反应条件为：94℃预变性，3min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环，延伸72℃6min，4