动物细胞培养和核移植技术上课

2.2.1动物细胞培养和核移植技术植物细胞工程常用的技术手段有哪些？那么动物细胞工程常用的技术手段呢？植物组织培养,植物体细胞杂交问题探讨最基础的是——动物细胞培养技术动物细胞工程常用的技术：动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞融合单克隆抗体等生活联系：烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人？一、动物细胞培养1、概念：从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。原理：细胞增殖如何进行动物细胞培养?结合问题，阅读书本，以小组为单位进行讨论，写出动物细胞培养的流程图。每组推选一位“小老师”，准备上台讲解学习活动一：合作学习（结合问题思考流程）1、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞呢？2、如何将动物组织分散成单个的细胞？3、胰蛋白酶的作用是什么？由此可说明细胞间的物质主要是什么成分？4、培养瓶或培养皿的内表面为何要光滑、无毒？5、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？动物机体组织单个细胞原代培养胰蛋白酶胶原蛋白酶稀释分装传代培养培养过程：原代培养原代培养时细胞生长可能会出现了哪些现象？贴壁生长接触抑制什么措施有利于贴壁生长？培养器具表面光滑、无毒什么措施有利于改善接触抑制？用酶稀释，分装培养培养过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶或胶原蛋白贴满瓶壁的细胞10代细胞原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系单个细胞加培养液遗传物质未改变遗传物质已改变动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。（分解弹性纤维）动物细胞培养不能最终培养成生物体用胰蛋白酶处理接触抑制细胞接触抑制细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。细胞贴壁：指培养过程中，细胞贴附在瓶壁上的现象。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒。一动物细胞培养原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。一般培养的第1代细胞与第10代以内的细胞称为原代细胞培养。传代培养：将原代细胞（10代以后）从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。有关概念：细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。遗传物质改变具癌细胞特点遗传物质未改变1、选用组织时，一般用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做培养材料，而不用老龄动物的，这是为什么？因为幼龄组织或器官上的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。老龄动物的细胞则相反。学习活动二：寻根问底，加深巩固2、胰蛋白酶处理组织时要注意什么问题？能够用胃蛋白酶代替吗？控制好消化时间，太长会消化细胞膜上的蛋白质不能，因为两者的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近.学习活动二：寻根问底，加深巩固3、动物细胞培养能否最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体学习活动二：寻根问底，加深巩固4、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？用于植皮的细胞培养应该不多于多少代？？保存10代以内的细胞；因为10－50部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展；10代学习活动二：寻根问底，加深巩固多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的知识，认为体外培养动物细胞应该模拟内环境的哪些条件呢？问题探讨：3、条件：1、无菌、无毒的环境2、营养3、温度和PH4、气体环境：补充合成培养基中缺乏的物质一动物细胞培养（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）36.5+0.5度；PH为7.2-7.4。O2作用：进行呼吸，提供能量CO2作用：维持培养液的PH值（95%空气和5%CO2）（葡萄糖、氨基酸、无机盐、微量元素、动物血清、血浆等。）有氧动物细胞培养条件：1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）3、温度和PH36.5+（-）0.5度,7.2-7.44、气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）O2作用：进行有氧呼吸，提供能量CO2作用：维持培养液的PH值保证细胞顺利的生长增殖防止污染获得细胞细胞的全能性植物体培养结果或细胞产物快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目学习活动三比较植物细胞和动物细胞培养细胞群体①生物制品的生产②用于基因工程③用于检测有毒物质④细胞的生理、病理、药理研究4、动物细胞培养技术的应用1．动物细胞工程常用的技术手段中，最基础的是A.动物细胞培养B.动物细胞融合C.单克隆抗体D.胚胎核移植练一练~~~2．贴壁细胞的分裂方式具体是A.无丝分裂B.有丝分裂C.减数分裂D.增殖3．关于动物细胞培养的叙述，不正确的是A.动物细胞培养前要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散开来B.通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养C.动物细胞培养只能传50代左右，所培育的细胞全部衰老死亡D.用于培养的细胞大都取自胚胎或幼龄动物的器官或组织练一练~~~2.自然界中有一种含有叶绿体的原生动物──眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实验方案。动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液原代培养细胞增殖部分细胞无限传代去掉组织间蛋白动物细胞培养不能最终培养成生物体传代培养根据动物细胞核仍具有全能性的特点,怎样将动物细胞的全能性表达?利用动物体细胞核移植技术理论基础：动物的细胞核具有全能性二、动物体细胞核移植技术1、概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称克隆动物二、动物体细胞核移植技术2、核移植的种类胚胎细胞核移植体细胞核移植（易）（难）学习活动四：思考探究1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达的奶牛，年产奶量为30.8t，创造了世界奶牛产奶量的最高记录。目前世界各国高产牛奶场的奶牛，平均每年产量为十几吨，而我国平均水平仅有3－4吨。你能想办法繁殖卢辛达的后代，使年产奶量为30.8t吗？（MⅡ卵母细胞）减数第二次分裂中期去核的卵母细胞供体细胞注入去核卵母细胞激活受体细胞，完成分裂、发育胚胎移植代孕牛子宫克隆牛3、过程：供体细胞（供核）细胞培养体细胞卵巢卵母细胞（MⅡ中期：供质）去核无核卵母细胞注入细胞融合重组细胞构建重组胚胎胚胎移植代孕母体生出与供体奶牛遗传基础相同的犊牛归纳:1.共分成两大阶段：核移植和胚胎移植2.取卵细胞作受体细胞的原因是:它是最大的细胞,易操作,它发育可直接表达性状3.严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞①加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育②保护濒危物种，增加存活数量③克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白④可以作为异种移植的供体4、应用前景：⑤可以用于组织器官的移植5、存在问题：①成功率低②克隆动物存在健康问题③克隆动物食品的安全性问题存有争议1.从母羊甲的体细胞中取出细胞核，注入到母羊乙的去核卵母细胞中，融合后的细胞经卵裂形成早期胚胎，再将胚胎移到另一只母羊丙的子宫内，出生的小羊大多数性状A.难以预测B.像甲C.像乙D.像丙练一练~~~2.下列有关克隆的叙述，不正确的是A.生物体通过体细胞进行的无性繁殖B.将某种瘤细胞体外培养繁殖成大量细胞C.扦插和嫁接实质上也是克隆D.将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA中练一练~~~问题1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？没有是成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理胰蛋白酶水解蛋白质细胞间的成份是蛋白质(胶原蛋白等)思考题６、细胞膜的主要成份是什么？７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？10、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？蛋白质和磷脂能注意时间的控制不能，因为两者的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛11、贴附性细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？13、如果此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？细胞株和细胞系通常是培养多少代的细胞?易于培养细胞贴壁，进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。将贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。这样的过程叫做传代培养思考题14、如何理解原代培养和传代培养？15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？16、有些为何能一直传下去吗？动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？17、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？用于植皮的细胞培养应该不多于多少代？上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养不是都能发生突变，朝着癌细胞方向发展不是保存10代以内的细胞；因为10－50部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展；10代思考题请看教材P48图2-21思考：1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？MⅡ中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。（三）体细胞核移植的过程（以高产奶牛为例）问题2在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植的胚胎或动物的遗传物质来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞核去掉或将其破坏。问题3用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，这是为什么？培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质也可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。问题4利用体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？克隆动物DNA主要来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。所以用体细胞核移植方法克隆的动物并不是供核动物完全相同的复制。