中试发酵罐操作规程

中试发酵罐操作规程一、准备*注：①发酵罐装液量一般在60~70%；②氯离子对不锈钢会带来不可逆转的破坏，因此应避免用盐酸溶液调节pH，如工艺上无法避免加盐酸，应控制盐酸溶液浓度不大于5%且在添加过程中不得直接接触不锈钢。1.启动发酵控制系统，启动蒸汽发生器。2.更换罐盖上各补料口橡皮塞，盖紧罐盖上各种盖帽，旋紧罐盖上压紧螺栓。3.进入控制器“标定”界面，标定pH电极，将pH电极、DO电极插入罐体侧面的传感器口并及时的锁紧螺母（确保安装妥当防止高压下传感器弹出伤人）。4.关紧发酵罐底阀（注意开关方向），倒入培养基，加入适量消泡剂。5.按下控制器下方搅拌开关，设定搅拌转速100Rpm并“自动”控制。调整pH值，盖紧投料口。6.开夹套排水阀，微开发酵罐出气阀，关紧其他阀门。7.如需控制PH，根据补料口大小选择适宜的补料针，准备补料瓶，并灭菌。8.如需补料，根据补料多少选择适宜的补料瓶或补料罐，并灭菌。二、培养基灭菌*注：①随温度升高，各压力均会有所增大，需随时调节压力。当往罐内通蒸汽后，发酵罐罐内压力会逐渐升高，当罐温达到121℃时，应控制罐压在0.1Mpa左右。②保温开始后，排气阀蒸汽排量不宜太小，否则可能导致液面以上的罐体部分尤其罐盖达不到消毒温度。③在灭菌完成前，启动空气压缩机和冷冻循环水机组。1.蒸汽进夹套：缓缓开夹套蒸汽阀（此时有轻微爆破声属正常，如声音过响，则开阀的速度应减慢）。待管道排水总口排出蒸汽时适当调节排水阀，控制蒸汽排出量以有少量蒸汽冒出即可。控制夹套内压力不超过0.15Mpa。2.当培养基预热至98℃时，适当调节夹套蒸汽阀，使培养基温度稳定在100℃左右，计时10min。此时,培养基中的溶氧接近零,标定溶氧的零点。此后微开或关闭夹套蒸汽阀。3.当培养基温度达到100℃，蒸汽进过滤器（如F3-500L、F4-2T罐过滤器一直保持正压，蒸汽另有管路可进罐）：微开过滤器上排冷凝水阀（部分罐有2个排冷凝水阀），缓缓开过滤器前蒸汽阀，排出蒸汽管道内冷凝水。当蒸汽过滤器的排冷凝水阀出口冷凝水很少时，开连接过滤器和发酵罐的切断阀，蒸汽进入发酵罐，调节排冷凝水阀，以有少量蒸汽排出为宜。调节切断阀（切断阀不得关死）和蒸汽阀，维持过滤器前蒸汽压力为0.1~0.18Mpa。4.当培养基温度达到100℃，蒸汽进取样器:开出料阀，开蒸汽阀，排出蒸汽管道内冷凝水。当出料口冷凝水很少时，调节出料阀，以有少量蒸汽排出即可。适当开大蒸汽阀，当蒸汽压力大于0.15Mpa，开发酵罐底阀，蒸汽从底阀进罐。调节蒸汽阀（可适当调节底阀），维持蒸汽压力为0.15~0.25Mpa。5.当达到预定温度（常为121℃），微开接种口盖子（除F4-2T罐）至有少量蒸汽排出，（开F2-50L罐移种管路的旁路阀和排气阀，至有少量蒸汽排出），根据罐温变化的趋势，及时调节蒸汽阀、排气阀。阀门调节宜微调应避免大幅度开关。当罐温维持在预定的范围内开始计时。三、灭菌完成及降温（先开后关，后开先关）*注：①在降温过程中，罐压会相应降低，始终监视罐压，严禁压力掉零。②在降温过程中，部分已关闭的阀门需二次关紧。1.旋紧接种口盖子、移种管路的旁路阀，微开排气阀。2.旋紧罐底阀，关紧出料阀，再关紧取样器的蒸汽阀。3.关紧空气管线切断阀及排冷凝水阀，关紧过滤器前蒸汽阀。关夹套蒸汽阀。4.微开进气量调节阀，全开进空气阀，开排冷凝水阀。待罐压降至0.05Mpa左右时，关排冷凝水阀，开空气管线切断阀，空气经过滤器、空气管线切断阀进入发酵罐。5.当罐温低于100℃，关夹套冷凝水阀，开夹套进冷凝水阀和回冷凝水阀（F3-500L、F4-2T罐开夹套进自来水阀和排水阀，温度较低后改成开夹套进冷凝水阀和回冷凝水阀开夹套进冷凝水阀和回冷凝水阀）。在控制器中将温度控制方式设定温度为并将控制方式设定为“自动”，发酵罐进入自动降温。6.在降温过程中，始终监视罐压，严禁压力掉零。当温度到达工艺要求时，调节搅拌转速、空气流量，调整罐压、标定溶氧电极斜率。四、接种及发酵1.摇瓶倒种:调节进气量调节阀至较低进气量，开排气阀至罐压接近零（不得大于0.02Mpa），予先旋松接种口，在接种口处放好酒精棉并点燃，打开接种口，倒入种子，然后旋紧接种盖，立即调高罐压。2.差压移种:①移种管线灭菌：关紧受种阀，开排冷凝水阀，开移种管线蒸汽阀，开移种管线切断阀，当排冷凝水阀处冷凝水排尽后调节移种管线蒸汽阀、移种管线切断阀以有少量蒸汽排出为宜。灭菌30分钟后，依次关紧排冷凝水阀、移种管线切断阀、蒸汽阀，并立即开受种阀，用受种发酵罐中的空气对移种管线进行保压。等移种管线冷却后就可以移种。②差压移种：调整种子罐与发酵罐的压力，维持种子罐罐压大于发酵罐罐压约0.05Mpa，开种子罐罐底阀，种液进入发酵罐。移种结束必须立即关紧受种阀并调高发酵罐罐压。（移种管线清洗时应避免移种管线中的蒸汽压高于发酵罐罐压，以免因受种阀泄漏导致发酵液被污染。）③发酵初始化：在控制器的发酵罐状态画面输入“发酵批号”，确认发酵开始时间，再按“发酵”开始，发酵数据才能自动保存。④发酵过程参数程序设定：根据发酵工艺要求，设定发酵过程参数及适宜的控制模式。3．补料①将经灭菌消毒的补料瓶及输液管放置于搁架上，用手动方式转动蠕动泵泵头，将输液管沿蠕动泵转动方向嵌入蠕动泵内。并用蠕动泵壳内的夹子夹紧软管。②旋下补料口上闷头，用酒精棉球对补料口内橡胶塞外表面消毒，然后将针头插入并穿透密封盖，并用补料针上的螺母锁紧。③打开蠕动泵手动开关，使输液管中充满料液。置蠕动泵开关于自动状态。根据发酵工艺要求设定控制方式及控制周期和脉冲。④酸碱液、消泡剂操作同补料操作。如需补料罐，移液操作同移种操作。4.A取样（F1-15L、F2-50L罐）①取样器消毒：半开取样阀，开蒸汽阀，蒸汽进入取样器，消毒时间20分钟。②关取样阀，关蒸汽阀，半开底阀，准备取样。③开取样阀取样。关底阀，取样结束。④开蒸汽阀，冲洗取样器10分钟，关蒸汽阀。B取样（F3-500L、F4-2T罐）①取样器消毒：半开出料阀，开蒸汽阀，蒸汽进入取样器，消毒时间20分钟。②关出料阀，关蒸汽阀，准备取样。③逆时针转动取样阀，进行取样。回转手柄，取样结束。④开蒸汽阀，冲洗取样器10分钟，关蒸汽阀。5.诱导①TB培养基培养大肠杆菌：接种后马上取样测OD600，作为空白样。每小时取样，当发酵液OD600-空白样OD600的值达到1时，降温至22℃，加入1%乳糖，再过1h后加入0.5%乳糖。②含玉米浆培养基培养大肠杆菌：PH值调准后，只补碱不补酸，待PH值上升、溶氧上升，降温至25℃，加入1%乳糖，再过6h后加入0.5%乳糖（乳糖可在降温后一次性加入）。6．放料：当检测OD600达到预期目标或不增长，或酶活达到预期目标时放料，放料是通过底部放料口放料，打开底阀和出料阀即可放料。放料完后，及时泄压，关空气管线切断阀、进空气阀、进气量调节阀。7.发酵结束：发酵结束必须在控制器在控制器的发酵罐状态画面按“存档”并确认后按“转存数据到目标文件夹”，发酵数据将自动整理并保存。8.洗罐（种子罐、补料罐清洗方法相同）①补料管夹上夹子，拔出补料针，拆下补料瓶，并及时处理剩余酸碱及补料，清洗补料瓶，补料口盖上盖子。②拔出PH电极和溶氧电极，放回原位，包好电极接线。③自来水冲洗发酵罐内壁，排尽，关底阀，往罐中放入自来水（如内壁较难冲洗，加入约1%片碱），开搅拌100RPM，夹套通蒸汽加热至100℃，维持约30分钟，排尽罐内的水。清洗结束。9.关闭发酵控制软件，关闭电脑，切断电源。如有疑问，请联系中试办公室，电话6729。2009年11月