谷氨酸循环及谷氨酸兴奋性毒性

谷氨酸循环及谷氨酸兴奋性毒性众所周知，谷氨酸是中枢神经系统最重要的兴奋性神经递质。谷氨酸不能通过血脑屏障。在脑内合成Glu的途径有4条[1]：(1)α-酮戊二酸接受氨基产生Glu；(2)γ-氨基丁酸(γ-amino-bu-tyricacid，GABA)经GABA转氨酶形成Glu；(3)鸟氨酸在鸟氨酸转氨酶的作用下产生谷氨酸半醛，后者进一步生成Glu；(4)谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下水解成Glu。而其中只有第4条途径来源的Glu发挥神经递质的作用。一．谷氨酸—谷氨酰胺循环神经系统中，神经胶质细胞（主要是星型胶质细胞，AC）与神经元的比例约为10：1。AC介于神经元与毛细血管之间，是血脑屏障的重要组成部分。正常状态下,神经元胞浆的Glu浓度在10mM/L,AC胞浆的Glu浓度在50至几百μM/L，胞外则为0.6,突触间隙为1μM/L,而突触终端囊泡可达100mM/L,胞内外Glu的浓度相差万倍以上。突触传递过程中，神经冲动传导至神经突触，神经末梢去极化，突触小泡通过突触囊泡和质膜融合而从神经元释放(即胞吐作用)。囊泡释放的Glu可使突触间隙的浓度由静息的1μM/L升高到1.1mM/L，维持在此峰值的时间约为1.2ms。[2]作用于突触后膜的各型Glu受体，传递神经冲动，发挥生理作用，同时，触发负反馈调节，并由AC膜上的谷氨酸转运体摄取，神经胶质细胞具有很强的Glu摄取能力，并含有谷氨酰胺合成酶，能将Glu转变成谷氨酰胺，再转运至突触前神经末梢胞质中，经谷氨酰胺酶脱氨生成Glu。同时，一部分经谷氨酸脱羧酶催化生成具有抑制作用的GABA。接着，Glu通过位于囊泡上的谷氨酸转运体将其转位进入囊泡内腔，并储存于囊泡中。在静息神经元(restingneuron)中，Glu在神经末梢的突触囊泡内以很小的膜结合细胞器形式储存。由此形成神经元和胶质细胞之间的“谷氨酸-谷氨酰胺循环”(如图)二．谷氨酸受体GluR分为亲离子型受体和代谢型受体(mGluR)。离子型受体包括:使君子酸受体(Quisqatate,QA)、海人藻酸受体(Kainate,KA)和N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-Methy1-D-Aspartate,NMDA)等共有十四种亚基,是与通道相连的受体一通道复合物，介导快速兴奋性突触传递过程，与神经系统发育过程中神经网络的形成、学习和记忆过程中的突触传递、可塑性改变等生理过程有密切关系;同时还介导脑缺血、颅脑损伤、神经变性疾病所致的神经元死亡的神经毒作用。后来又发现d-氨基-3-羟基-5-甲基-4异恶唑呤(AMPA)作用于QA受体,较QA受体本身是更有效的激动剂,所以又称QA受体为AMPA受体。代谢型谷氨酸受体(mGluRs)是一个与G一蛋白偶联的受体家族，通过激活G一蛋白产生第二信使而发挥其生物学效应。根据mGluRs氨基酸序列的同源性、胞内信号转导机制以及药理学特性，分为三型共计八种亚型(表1)。即Ⅰ型：mGluR1，mGluR5。Ⅱ型：mGluR2，mGluR3。Ⅲ型：mGluR4，mGluR6，mGluR7，mGluR8。研究证实，多数mG1uRs位于突触前膜，对谷氨酸(及其它神经递质)的释放发挥负反馈调节，通过突触前机制对谷氨酸的释放产生抑制作用。而I型mGluRs主要位于突触后〔2〕，被激活后可加强离子型受体的效应。mGluR1,5激活细胞内磷酸脂酶C,该酶使磷酸肌醇脂分解为磷酸肌醇(IP23)和二脂肪酰甘油脂(DAG),IP23诱导细胞内Ca2+释放;II型mG1uRs位于突触前而不是突触后[3〕。Shigemot等〔4〕利用免疫组化及电镜技术详尽观察了mG1uRs在海马的分布及突触定位。结果显示，mGluR2，3位于突触前而不是突触后。电镜观察证实了mGluR2，3的突触前定位，但同时发现它们并不是位于释放递质的活性区，而是在远离活性区的外突触区。Yokoi[5〕利用mG1uR2基因敲除的小鼠明确显示了该受体在海马的突触前定位。有报道认为，mG1uR:基因敲除的小鼠并不显示功能异常，这意味着mG1uR2对正常的兴奋性突触传递可能不发挥重要作用[6]。mGluR4，mGluR6，，mGluR8同样位于外突触区。,mG1uR4,mG1uR8对谷氨酸具有很高的亲和力(分别为0.3一20,0.04一5,3一38,3一11μM/L)[7]，这符合它们的突触定位，因为这四种受体均位于远离活性区的外突触区，不大可能获得与活性区相同的谷氨酸浓度，只有亲和力很高才有可能被激活。与其它mG1uRs相比，mG1uR7在脑内分布最广，且研究最充分，积累资料也最多〔1,4,7,8]。mG1uR7的突触前定位，恰好位于轴突末梢的活性区，与其他mG1uRs相比，mGluR7与内源性配体谷氨酸的亲和力(EC50lmmol/L)远低于任何一种突触前受体。实验发现，谷氨酸浓度需达到毫摩尔级水平，才能激活mG1uR7，从而观察到该受体激活后产生的对CAMP的抑制〔4)正常突出传递中，突触间隙谷氨酸浓度峰值约为1.1mM/L，非常符合位于活性区且作为突触前自身受体的mG1uR:对谷氨酸的亲和力，即它对谷氨酸的亲和力很低，需很高浓度的谷氨酸才能被激活。有可能被激活。mG1uR7非常符合突触前自身受体的条件。因而当递质由囊泡释放至突触间隙，激活突触后受体产生突触后效应时，在一定条件下也使作为突触前自身受体的mGluR7兴奋，发挥对递质释放的负反馈调节，从而使突触间隙的递质浓度维持在生理水平;而其它位于突触前的mG1uRs都是在远离活性区的外突触区，生理条件下突触传递所释放的递质量不可能激活这些受体。只有在异常情况下，递质过量释放才能使其由活性区溢出(spillover)至外突触区，激活这些受体，抑制递质的再释放。这样看来，对突触传递过程中递质释放的调控至少存在两种机制，即正常突触传递的情况下，由mG1uR7作为自身受体发挥的负反馈调节;以及在异常情况下，由于递质过量释放激活的mG1uR2,mGluR3,mG1uR4,mGluR8发挥的对递质释放的负反馈调节。另外，还存在着突触前mGluRs对其它递质如GABA释放过程的调节机制。因此，突触前mGluRs，对突触传递过程递质的释放，存在一整套复杂而完善的调控机制。三．谷氨酸转运体和谷氨酸胱氨酸转运体（一）谷氨酸转运体现在已知的谷氨酸转运体有两种：高亲和力转运体(也称为兴奋性氨基酸转运体，excitatoryaminoacidtransporters，EAATs)和低亲和力转运体(也称为囊泡膜谷氨酸转运体，ve-sicularglutamatetransporters，VGLUTs)。1高亲和力转运体位于细胞膜共有5种，分别为：GLAST(EAAT1)、GLT-1(EAAT2)[9,10]、EAAC1(EAAT3)、EAAT4[11,12]和EAAT5[13]。其中GLAST、GLT-1主要在星型胶质细胞表达，在终止谷氨酸能神经传递、维持细胞外液Glu浓度处于低水平、防止其兴奋性毒性作用以及对过量Glu的转运中发挥着主要作用[14]。脑内谷氨酸的清除主要由这二者承担，并以GLT-1为主。高亲和力转运体对Glu的转运功能具有Na+依赖性,胞内外的Na+浓度差为其提供势能[15]。在正常情况下，胞外Glu与EAAT结合后，顺着Na+的浓度梯度共同转运至胞内，EAAT每摄取1个Glu-同时摄入2个Na+和1个H+，并排出1个K+和1个OH-(或HCO3-)，从而产生内向电流，因此转运是生电过程。Na+-K+泵来维持细胞内外Na+、K+的正常浓度，因此EAAT转运Glu是一种离子依赖性的耗能过程，整个转运过程是可逆的，当跨膜浓度差逆转时，EAAT可变摄取为释放Glu。2低亲和力转运体VGLUTs有3种：Ⅰ型囊泡谷氨酸转运体(VGLUT1)、Ⅱ型囊泡谷氨酸转运体(VGLUT2)和Ⅲ型囊泡谷氨酸转运体(VGLUT3)。VGLUTs分布于囊泡膜上，它能够特异地将突触囊泡外的Glu转运进入突触囊泡内[16，17，18]。VGLUTs与EAATs生理作用不同，其Glu的摄取由横跨囊泡膜并由空泡型三磷酸腺苷酶(vacuolar-typeATPase)产生的质子依赖的电化学梯度(protondependentelectrochemicalgradient)所驱动，并具有严格的底物特异性(对L-Glu高度特异)和相对低的亲和性(Km=1－3mmol/L)，主要依赖于囊泡膜电位梯度的存在，而不是pH梯度。对于它的最大活性来说，低浓度的氯化物(2－5mmol/L)是必要的[19]（二）谷氨酸-胱氨酸转运体谷氨酸-胱氨酸转运体在脑内主要分布于星形细胞与神经元。生理状态下释放1分子的谷氨酸,摄取1分子胱氨酸入胞,两者藕联转运。胱氨酸在胞内迅速被还原成半胱氨酸,一部分参与胞内重要自由基清除剂谷胱甘肽的合成,另一部分则出胞氧化成胱氨酸,重新参与谷氨酸-胱氨酸系统循环。谷氨酸-胱氨酸转运体转运功能依赖于谷氨酸及胱氨酸跨膜浓度差高低,而非Na+依赖性,提高突触间隙谷氨酸浓度可抑制胱氨酸的摄入,提高胞内胱氨酸浓度也可抑制谷氨酸的释放,两者相互抑制[20]。高浓度谷氨酸情况下,胞内外的谷氨酸浓度倒置将出现反方向转运,胱氨酸摄取被阻滞。由于Xc-系统的胱氨酸摄取是谷胱甘肽合成的限速步骤[21],因此胱氨酸的摄取阻滞导致胞内谷胱甘肽合成减少,造成氧自由基的堆积,广泛攻击细胞超微结构,尤其是线粒体,介导后续反应,导致细胞损伤乃至死亡。四谷氨酸的兴奋性毒性当脑出血，脑外伤，或其他理化因素导致脑神经细胞外液Glu剧增时，过度刺激谷氨酸受体会引起引起神经兴奋性毒性。Glu与突触后非NMDAR(QA/KA受体,现称AMPA、KA受体)结合,Na+通道开放,大量的Na+向细胞内移动,可以在伤后1～2小时内出现急性细胞肿胀,甚至溶解,造成立即性神经元死亡,是第一阶段;另外,大量Glu与NMDAR结合,使Ca2+通道反复开放,且NMDAR结合时间较长,导致大量Ca2+内流、超载,可从伤后24小时延长到5～7天,成为延迟性细胞死亡,是第二阶段。此两阶段变化因非NMDAR和NMDAR分布重叠,反应交错,加上代谢型GluR激活使细胞内钙池大量释放Ca2+,出现致死性的Ca2+超载,细胞膜的自溶进入独立过程,导致一系列严重后果。线粒体功能不全是Glu神经毒性的主要步骤,过量Ca2+沉积在线粒体,干扰线粒体呼吸链功能,氧自由基生成增多。氧自由基攻击膜结构,通透性增加,Ca2+内流加剧,Na+—Ca2+交换加强。Ca2+也可激活细胞内信号传导系统调节细胞功能或加速死亡。另外线粒体释放细胞色素C也介导细胞死亡。NMDAR过度激活还通过对GluR依赖性离子通道的开放作用引起Ca2+内流,继而引起Cl-和水的转移。以上过程引起细胞器的肿胀和胞膜的渗漏与细胞坏死过程相符。GluR的过度激活在一定条件下也可以引起细胞的凋亡,而且越来越多的证据表明凋亡在脑损伤病理生理中也发挥重要作用[22]。Zhivotovsky[23]等将细胞色素C注入细胞内,发现细胞色素C可诱导细胞凋亡。Ca2+激活核酸内切酶,凋亡基因的表达促进细胞死亡。NMDAR的激活与线粒体形成活性氧自由基(ROS)有关[24],而许多研究证实氧化性损伤可独立引起神经元的凋亡,因而ROS的形成是神经元凋亡的早期标志之一。当损伤较温和时,也可通过凋亡方式死亡,而细胞的成熟度也是调节因素之一,“年轻”细胞更倾向于细胞凋亡[25]。Ankarcrona将培养的神经细胞暴露于低浓度的神经兴奋性毒素,大多数的细胞表现出染色质凝聚、凋亡小体形成等凋亡的形态学改变。在分子水平,有学者发现这种神经兴奋性毒素所诱导的凋亡与Caspase-3激活相关联,而Caspase-3抑制剂可使其减少[26]。NMDAR的激活还可以通过破坏细胞内外K+的平衡诱导细胞凋亡。细胞内K+的外流和浓度的降低可促进凋亡,在体外实验中,通过增加细胞外的K+浓度而抑制K+的外流可减少神经细胞的凋亡,其具体机制存在争议。有人认为细胞内K+浓度低于生理水平可激活Cas