苏州科技大学基因工程期末复习整理

1名词解释：基因工程：在体外对不同生物的遗传物质进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物的工程技术体系。限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列．并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶异源同序酶（同裂酶）：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶星号活性：在某些反应条件下，限制酶识别顺序的特异性可能发生变化，结果一种限制酶酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点，得到不同的酶切片断，这就是限制酶的星号活性酶单位：是指在最适条件下完全消化1ugdsDNA所需要的酶量逆转录酶：一种有效转录RNA成为DNA的酶，产物为cDNA,（互补DNA）由两种亚基组成，带有聚合酶活性和外切酶活性。载体：携带外源基因进入受体细胞的工具质粒：质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子多克隆位点（MCS）：是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段很短的DNA序列。Cosmid：是一类由人工构建的含有l-DNA两端cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。M13：是一种单链DNA噬菌体单链DNA利用宿主细胞的复制另一条链（负链），形成dsDNA（RFDNA）宿主细胞不会发生裂解EST（表达序列标签）：指基因序列中一段能特异的标记或表征基因的序列外源基因：通常指插入到载体内的那个特定的片段基因目的基因：指那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段cDNA基因文库：某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌群体中受体细胞或称宿主细胞：能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。转化率：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。感受态细胞：处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞转染：将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞，把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程转化重组子通过与膜蛋白结合进入受体细胞并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。诱导：可诱导基因在特定环境中表达增强的过程可诱导基因：特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因可阻遏基因：基因对环境信号应答时被抑制，这种基因是可阻遏基因阻遏：阻遏基因表达产物降低的过程接合转化法（三亲本杂交接合转化法）：基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式分子探针：具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的DNA分子、RNA分子和蛋白质分子基因表达：在一定调节机制控制下，基因经过转录及翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程管家基因：某些基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达包涵体（IB）：在某些生长条件下，E.coli能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地聚集在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构基因沉默：是导致外源基因不能正常表达的重要因素，主要表现在转基因植物与转基因动物中精准医疗：它是根据个体基因特征，环境以及生活习惯，为病人量身设计最佳治疗方案，以期达到治疗效果最大化和副作用最小化的一种定制医疗模式基因芯片：利用核酸杂交原理检测未知分子的技术。通过大量探针分子固定在支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交型号的强弱而判断样品中鞭分子的数量同裂酶：一种限制性内切酶虽来源不同，但具有相同的识别序列同尾酶：有些限制性内切核酸酶虽然识别序列不同，但是酶切DNA分子所得的DNA片段具有相同的的粘性末端，2这件的一组限制性内切核酸酶穿梭载体：两种生物中均以质粒形式存在，在一种生物中以质粒的形式存在，另一种生物中以质粒或病毒形式存在协调表达：在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，这种调节称为协调调节转基因：是指在DNA操作过程中整合到动植物受体染色体上的外源基因。报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因信号肽：是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短（长度5-30个）氨基酸的肽链。SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA的3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。填空：（课堂作业参考作业本）基因工程诞生的技术突破：限制性内切酶、DNA连接酶、载体、感受态体系。琼脂糖凝胶电泳、DNA测序技术基因工程的特征：1、跨物种性：外源基因到另一种不同的生物细胞中进行繁殖2、无性扩增：外源DNA在寄主细胞内可大量扩增和高效表达基因工程三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA双螺旋结构和半保留复制、中心法则和遗传密码基因工程三大技术基础：限制性内切酶、DNA连接酶、载体限制酶属（内切酶）作用对象（dsDNA）限制酶末端种类：平齐末端、黏性末端（5`—伸出粘性端，3`—伸出粘性端）基因工程的主要操作内容：1、目的基因的获取2、重组体的制备3、重组体的转化4、克隆鉴定5、目的基因表达限制修饰系统的种类：（I型，*II型，III型）只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。双酶消化：1、反应条件相同：同时加到反应管，同时反应2、对温度要求不同：先低温消化，再高温消化3、对盐浓度要求不同：先低盐酶消化，再高盐酶消化）常用的限制性内切酶：（EcoRI（GAATTC/CTTAAG）HindIII和BamHIGGATCC）单一限制酶酶切位点的创立：消除反应、邻近反应构建物理图谱的常用方法：部分消化法、双酶消化法T4DNA连接酶：特点：只连接ds-DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基用途：1)相同或相容粘性末端的连接2)平整末端的相连制备cDNA库的常用方法：用mRNA为模板合成单链cDNA，或以单链cDNA合成双链cDNA常用基因工程载体包括：质粒载体、噬菌体载体（病毒载体）、Cosmid载体、蓝藻基因克隆载体、YAC载体对天然载体的改造主要考虑如：大小、标记基因和单一多种的限制性酶切位点标记基因的种类：1、抗性标记基因（Apr或Ampr，Tcr或Tetr）2、营养标记3、生化标记4、噬菌斑基因工程安全性环节:选择非结合型质粒2、构建琥珀型密码子突变体3、包装蛋白人工组建克隆载体-pBR322：大小：4.3kb选择标记：Apr、Tcr单一酶切位点：EcoRⅠHindⅢBamHⅠPstⅠ等YAC:酵母人工染色体：装载容量：50Kb---2000KbpUC是基因工程中目前最常用的E.coli克隆载体λphage：48.5kb75%（36.4kb）~105%（50.9kb）插入型：14kb置换型：25kbλphage改造：1、缩短长度2、删除重复切口Cosmid：大小5kb包装大小为50.9-5kb=45.9kb不能在体内被包装更不能裂解细胞，因此形成的是菌落而不是噬菌斑BAC：细菌人工染色体，装载量为300kb终止密码子有三种：UAA（赭石）UGA（乳白）UAG（琥珀）琥珀型突变：CAG—UAG（stop）3基因表达的特性：时间特异性阶段特异性大多数基因的表达产物是：蛋白质,部分基因如tDNA和rDNA基因表达产物是RNA。基因表达过程体现了中心法则的内容，即遗传信息的流向是从DNA到蛋白质。基因表达的调控元件：启动子、启动子、终止子、衰减子、绝缘子、反义子目的基因的分离：遗传互补法、核酸杂交法、免疫法遗传互补法：优点：简便，快速，可靠，是首选方法。获得的基因一定是完整基因。缺点：适用范围较窄。必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。核酸杂交法：优点：不需要基因表达，必备条件：合适的核酸探针或有关资料，外源DNA能在宿主细胞中扩增免疫法：优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决定序列能被正确表达必备条件：待分离基因的表达产物—蛋白质必须纯化和用于制备相应抗体差别杂交法的应用前提需拥有2中不同细胞群，即1个可正常生长，另1个基因不表达抑制性减法杂交（SSH）技术：该法是一种用于分离和鉴定差异表达基因的革命性方法，特别适宜于那些差异表达量很低的基因，其富集效率在1000倍以上。基因打靶方法：1、正负选择法（G418）正筛选选出含有neo基因，再用（丙氧鸟苷）作负筛选，淘汰含有tk基因的细胞体2、正相选择性：将人的（tPAC-DNA）克隆复制重组子（转化哺乳动物细胞系）转化株用（Mtx）处理，tPA编码序列随dhfr，新转化株在大规模细胞反应器中产生高水平的tPA精准医疗的特点：针对性、高效性、预防性基石为：基因测序基因测序的作用：测定未知序列、确定重组DNA的方向与结构；对突变进行定位和鉴定、进行比较研究探针的制作过程：1、测氨基酸顺序2、推测mRNA3、根据兼并性与探针进行杂交4、制备抗原、抗体探针合成需要考虑：1、生物体对简并密码子的偏爱性2、探针应具有足够的长度通常为17~20个核苷酸3、探针内部不应出现可能的互补区域探针的种类：1、DNA/RNA探针2、寡核苷酸探针3、PCR探针核苷酸探针种类：1、同源或部分同源探针2、cDNA探针3、人工合成的寡核苷酸探针探针标记：放射性标记32P3H35S非放射性标记生物素探针标记方法：切口平移标记法、随机引物标记法、末端标记法重组子筛选的目的：用来区分转化子与非转化子，重组子与非重组子，目的重组子与非目的重组子核酸杂交分析的基本原理：碱基互补配对标记探针的方法：1、切口平移标记法2、随机引物标记法3、末端标记法(3`凸出末端的加尾标记法，双链DNA3`隐蔽末端的填充标记，5`端标记)4、逆转录酶Southern印迹杂交针对DNANorthern印迹杂交针对RNA重组DNA分子导入宿主细胞：以质粒为载体：转化作用、接合作用以噬菌体为载体：转染作用、转导作用避免外源基因表达蛋白被降解的解决办法：1、构建融合蛋白表达系统2、构建分泌蛋白表达系统3、构建包涵体表达系统4、选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统）基因沉默作用机制：位置效应的基因沉默；转录水平的基因沉默；转录后水平的基因沉默cDNA基因文库的构建：1、细胞总RNA的制备及mRNA的分离；2、cDNA第一条链的合成；3、双链cDNA的合成（自身引导、置换合成、引导合成）；4、cDNA与载体的连接，重组到相应的载体上，导入受体细胞增值，表达型cDNA文库的构建：λgt11非表达型cDNA文库的构建：λgt10重组DNA分子导入宿主细胞：以质粒为载体：转化作用、接合作用以噬菌体为载体：转染作用、转导作用转换率的影响因素：载体及DNA重组分子方面：1、载体本身性质2、载体空间构象3、插入片段的大小。受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配基因插入型载体：插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。基因置换型载体：置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。简答：4引起星号活性的可能因素：甘油浓度过高、离子强度不合适、阳离子的变化、溶液中PH值的变化在基因工程操作中，应避免星号反应的出现影响限制酶消化DNA的若干因素DNA的纯度的影响、DNA浓度的影响、酶浓度的影响、酶反应条件的影响、双酶消化作为基因工程载体的基本功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件作为基因工程载体必须具备的基本条件1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记质粒的特征及分类：1、自我复制性2、不相溶性3、携带遗传标记4、可扩增性（氯霉素扩增）分类：结合型和非结合型、严紧型和