荧光传感器及分子识别

《荧光分析法》课程论文赵劲松200425135第1页共16页基于激发态过程机理的荧光传感器及离子识别赵劲松200425135摘要：荧光化学传感器融合了超分子化学、光物理化学、有机合成化学的研究内容，由于其具备荧光分析法的高灵敏度特点而引起人们的普遍关注。不同的荧光传感机理被应用到传感器的设计上，以适应不同的传感体系。本文综述了几种激发态过程的荧光传感机理并介绍其在离子识别中的应用。关键词：荧光化学传感器光物理传感机理离子识别一、前言分子识别是超分子化学研究的核心内容之一，最初是由有机化学家和生物化学家在分子水平上模拟天然化合物所提出。分子识别是指主体（受体）对客体（底物）选择性结合并产生某种特定功能的过程，维系分子间的作用力是几种弱相互作用力（非共价键）的协同作用。分子识别可分为离子客体的识别和中性分子的识别。当客体与受体的识别基团结合时，诱导受体的物理或化学性质发生改变，转换为可检测的宏观信号：如NMR中的化学位移变化、光学信号（吸光度或荧光）的变化以及电位的变化等，此过程即为传感。化学传感器是一类转换器，可选择性地将分析对象的信息(如酸度、浓度、粘度、化学或生物物种等)转变为分析仪器易测量的物理信号。目前，电化学与光化学传感器是两个活跃的研究领域。得益于现代电子技术的发展，电化学传感器出现较早，该领域的研究十分活跃，新技术新方法不断出现；光化学传感器的出现相对较晚，然而该研究领域所独具的应用性为其发展提供了便利条件，因此迅速成为现代分析化学的前沿研究领域之一。由于荧光内在的高灵敏度、可实时检测及可实现远程检测等优越性，其在分子识别与传感中得到蓬勃发展。与其它化学传感器相似，荧光传感器包含两个单元：一是识别基团，另一是荧光团。二者可由联接臂相联或直接相联在同一共轭体系中。分析对象被识别时，荧光团内在的光物理特性被影响，荧光信号的输出形式发生改变，例如荧光峰值位置的移动，荧光量子产率的涨落，荧光寿命的变更，荧光偏振的改变以及新荧光峰的出现等。因此荧光团可起信息转化的作用，即将识别信息转化为光学信号，《荧光分析法》课程论文赵劲松200425135第2页共16页涉及的机理有光诱导电子转移（PhotoinducedElectronTransfer,PET）、荧光共振能量转移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET），分子内电荷转移（IntramolecularChargeTransfer,ICT）、激基缔合物（Monomer-Excimer）的形成或消失、激发态分子内质子转移（Excited-stateIntramolecularProtonTransfer,ESIPT）等，这些属于光物理研究领域。准确评价荧光信号的改变并对光信号的改变作出合理的机理解释，则需对光物理化学过程有全面认识。本文将概述上述几种激发态信息传递机制并介绍其在离子识别与传感中的应用。二、光诱导电子转移（PET）机理PET热力学基础由Weller等于20世纪60年代末提出，用于描述分子间电子转移体系。这一开创性工作为光诱导电子转移体系的深入研究奠定了基础。根据Weller公式：ΔG=Eox-Ered-ΔE0,0-C（Eox和Ered分别为给体化合物和受体化合物的氧化和还原电位，ΔE0,0为受激化合物跃迁能量，C为常数），当ΔG为负值时，就会发生从电子给体到电子受体的电子转移。对于分子内的PET动力学过程则有Marcus理论描述。在荧光传感器的研究中，光诱导电子转移最先得到研究并取得巨大的成功。图1描述了PET荧光传感器的光物理机理。客体不存在时，荧光团被光激发后其最高占据轨道(HOMO)的一个电子跃迁到最低空轨道(LUMO)，若外来基团（如识别基团）的HOMO轨道或LUMO轨道介于荧光团两轨道能量之间，此时就可以发生识别基团与荧光团的电子转移而导致荧光的猝灭，即发生光诱导电子转移过程。也就是说，PET过程提供了一个电子从激发态到基态的非辐射跃迁的途径，AB图1.A.外来基团的HOMO轨道介于荧光团HOMO、LUMO轨道之间时便会发生从外来基团向荧光团方向的电子转移。B.外来基团的LUMO轨道介于荧光团两轨道之间时便会发生从荧光团向外来基团方向的电子转移。《荧光分析法》课程论文赵劲松200425135第3页共16页降低了荧光团的量子产率，表现为荧光强度的减弱，既荧光猝灭。PET应用到传感器上一般需要如下几个条件，首先传感器分子中要包含一个荧光团，其应具有高的量子产率；其次还应包含电子给体（ElectronDonor），可以发生向荧光团的PET过程；最后，当结合目标分子（或离子）后，会引发或抑制电子给体与电子受体间的光诱导电子转移，引起荧光团荧光猝灭或荧光恢复，实现信号报告目的（图2）。2.1基于PET过程的阴离子识别与传感就大多数PET荧光传感器而言，其荧光团一般选用稠环类芳香化合物，因为该类化合物具有刚性平面结构，量子产率较高，具有较强的荧光发射。同时由于分子内的电子离域特性，常被看作能容纳大量电子的场所。识别基团一般含有脂肪胺或芳香胺，其上的孤对电子可作为PET过程中的电子给体，以作为荧光团的猝灭剂。荧光分子1为首例利用PET机理识别阴离子的荧光分子传感器[1]。其以蒽为荧光团，多胺阳离子为阴离子的识别位点。在进行阴离子识别前，先对多胺进行部分质子化，残留一个自由氨基作为荧光团蒽的猝灭剂。当HPO42-的加入后，其羟基与残余氨基孤对电子结合后，阻断了PET的发生，使可使蒽荧光得到恢复，表DDhυhυe-hυ'WeaklyFluorescentStronglyFluorescent图2.基于PET机理的荧光传感器模型1《荧光分析法》课程论文赵劲松200425135第4页共16页现为受体分子荧光显著增强，实现在在pH=6的水中选择性识别磷酸氢根离子(HPO42-)。受体分子2以硫脲盐类为阴离子识别位点，荧光团为萘。在激发态时，会发生从萘向硫脲盐方向的PET过程，致使萘的荧光被猝灭，在乙腈中，阴离子如AcO-与硫脲盐以静电吸引和多重氢键协同作用结合后，提高了硫脲盐的还原电位，阻断了PET的发生，荧光强度显著增强，可实现在水中识别HPO42-和AcO-，其与HPO42-形成2:1的配合物[2]。2.2基于PET过程的阳离子识别与传感较PET机理识别阴离子而言，阳离子的荧光识别起步较早。大多数PET机制阳离子传感器分子中，一般将结合阳离子的受体设计成电子给体，而将具有荧光发射特征的荧光发光体设计成电子受体。受体分子3是选择性识别Hg2+的PET传感器[3]。萘酰亚胺是分子3的荧光团，2，6-二胺甲基吡啶上的氮原子既是荧光团的猝灭基又是金属离子的结合位点，其半23图3.受体分子3与金属离子结合后的荧光发射光谱《荧光分析法》课程论文赵劲松200425135第5页共16页刚性结构可增强与金属离子结合的选择性。在pH=6.98的HCl-Tris缓冲溶液中受体自身的荧光较弱，荧光量子产率为0.007，过渡金属离子中的Zn2+、Cd2+、Ag+和Pb2+均能使3的荧光不同程度的增强(Φ/Φ03)，唯有Hg2+使其的荧光增强17倍，其它金属离子的加入并不影响3的荧光行为。受体分子中的羟基可增加分子的水溶性，可实现水相中Hg2+的选择性识别。同样为选择性识别Hg2+的荧光传感器，受体4以荧光素为荧光团，同时在受体中引入硫原子以增加与Hg2+的结合能力。在pH=7的缓冲溶液中，受体4存在从苯胺到荧光素的PET过程，荧光量子产率仅为0.04。随着Hg2+的加入，苯胺到荧光素的PET过程被抑制，受体的荧光强度增加5倍，光谱略有红移。干扰实验表明除Cu2+外，其它金属离子的存在对Hg2+的检测并不干扰[4]。三、荧光共振能量转移（FRET）机理荧光共振能量转移是激发态时能量供体与受体通过远程偶极-偶极耦合作用，发生的非辐射能量转移过程，又称长距离能量转移。一般说来，能量供体的荧光发射位于短波长处，且其发射光谱与能量受体的吸收光谱要能重叠。描述荧光共振能量转移有著名的Forster方程：kT＝1/τD(R0/r)6，kT为能量转移的速率，τD为没有能量受体条件下能量供体的荧光寿命，R0为Forster距离，r为能量转移效率为50％时的供体与受体间的距离，为供体与受体间的距离。有此可见，共振能量转移的效率与以下三个因素有关：供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠程度，供体与受体间的距离和供体与受体的跃迁偶极的相对取向。FRET在生物分析中的荧光探针方面取得巨大的成功，主要利用共振能量转移与能量供体受体间的距离有关这个因素，而且这在生物蛋白质、DNA大分子上容易实现。但对于单分子传感器而言，能量受体与供体间常用柔性的非共轭化hv4《荧光分析法》课程论文赵劲松200425135第6页共16页学键连接，因此可以通过客体结合后引起分子构型变化，改变供体与受体间距离来进行FRET传感。此外还可利用受体与供体的光谱重叠程度、跃迁偶极距的相对取向，以及供体的量子产率等影响因素进行荧光传感。受体分子5是利用共振能量转移原理识别F-的传感器[5]。在四氢呋喃溶液中，以294nm（三芳基硼的吸收带）激发，只观察到位于670nm的卟啉的荧光发射峰而观测不到三芳基硼基团的荧光发射，说明发生了从三芳基硼到卟啉的能量转移过程。氟离子加入后与硼反应，使硼原子的杂化轨道由sp2变为sp3，进而减弱了体系的π共轭，阻断了能量转移的发生，于是产生两个新的荧光峰，分别位于356nm（三芳基硼的发射）和692nm（卟啉的发射），而位于670nm处的荧光强度减弱，说明由三芳基硼到卟啉的能量转移被阻断。因此该体系可用于比值法检测氟离子。该受体能对F-专一性识别，其它阴离子的加入不会引起受体分子的荧光光谱变化。分子6中，芘为能量供体，蒽-9-羧酸酯为能量受体，杯芳烃为Na+的结合位点。在甲醇-四氢呋喃(15:1)的混合溶剂中，可同时观察到芘和蒽-9-羧酸酯的荧光发射。随着Na+的加入，相对于芘的荧光发射，蒽-9-羧酸酯的荧光增强程度更大，说明Na+的加入使芘与蒽-9-羧酸酯间的距离减小，能量转移效率提高[6]。图4.受体分子5对F-的荧光传感56OR4OR3R2OOR1R1=OOOOOR3=R2=R4=OEtO《荧光分析法》课程论文赵劲松200425135第7页共16页受体分子7未结合阴离子时存在从芘（能量供体）到2,3-二吡咯-喹喔啉（能量受体）的共振能量转移，以325nm（芘的吸收带）激发，观察到位于495nm的2,3-二吡咯-喹喔啉的强荧光发射峰。随着阴离子（F-或HPO42-）的加入，2,3-二吡咯-喹喔啉的荧光强度减弱，且其吸收光谱也发生变化，表明FRET过程受到抑制。通过对比实验，发现跟单独的2,3-二吡咯-喹喔啉相比，受体7通过FRET进行传感的灵敏度有所提高[7]。受体分子8利用结合前后供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠程度的不同，从而选择性进行Al3+的传感[8]。分子中邻羟基苯基三唑自身不发荧光，与Al3+结合后荧光有所增强（尽管仍很弱），但其发射光谱与香豆素343的吸收光谱重叠程度大为增加，能量转移效率提高，达到信号放大之目的。在甲醇-水（1:1）的pH5.0缓冲溶液中，以350nm光激发受体8（邻羟基苯基三唑的吸收峰），Al3+的加入使香豆素343的荧光增强7倍，检测限为50nM，其它金属离子除Cu2+和Fe3+使受体8荧光猝灭外，对测定无影响。87FRETλλλλ:315~365nmλλλλ:495nm《荧光分析法》课程论文赵劲松200425135第8页共16页四、激基缔合物（Excimer）机理一些荧光团在激发态与另一相同/不同荧光团接近，往往能生成激基缔合物（如萘、蒽、芘等易于通过π-π堆积作用形成激基缔合物），此时可观察到双重荧光。位于短波长处且具有振动结构的荧光为单体荧光，长波长无振动结构的荧光为激基缔合物荧光（图5）。**AAAA+→ɺɺɺɺ激基缔合物(excimer)激基缔合物的形成过程受扩散控制，因此单体浓度与溶剂粘度是缔合物形成过程中的决定因素