2012级《微生物学实验》指导手册

《微生物与微生物工程实验》指导手册西北师范大学生命科学学院微生物学团队2014年9月编制目录前言......................................................................................................................................1微生物实验室安全须知.......................................................................................................2微生物实验注意事项...........................................................................................................3微生物与微生物工程实验用器材一览表............................................................................9微生物与微生物工程实验教学进度表（必修）...............................................................10实验设计方案与实验报告撰写要求..................................................................................11实验内容指导....................................................................................................................12实验一(I)普通光学显微镜的使用............................................................................12实验一(II)细菌的涂片及简单染色法.......................................................................16实验二四大类微生物菌落及细胞形态的观察...........................................................19综合大实验(三~十)产酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化........................25附录....................................................................................................................................32附录1微生物实验常用菌种及其学名.......................................................................32附录2常用培养基成分及其配制...............................................................................33附录3常用染色液和试剂的配制...............................................................................36附录4常用缓冲液配制表...........................................................................................40附录5常用消毒剂表..................................................................................................41参考文献............................................................................................................................421前言为适应现代大学开放性、综合性、创新性实验教学改革的要求，经微生物学团队讨论，在2012级生物技术和制药工程专业开展《微生物与微生物工程实验》教学改革初步尝试。本实验指导手册只提供实验内容的基本纲要、基本思路、基本方法和主要参考书目，具体的实验内容（实验三~实验十）须要同学们借助微生物学及相关课程的理论和实验教材，在教师的辅助指导下，自主设计、自主实施、协作分工。希望通过本次实验教学改革，达到以下目的：1、通过一个综合设计实验，贯穿微生物学研究的主要技术和方法，使实验内容系统化、整体化，使同学们对微生物学研究技术和方法的认识更加系统全面；2、通过自主设计、实施实验，提高同学们对实验课程的积极性和主动性，培养同学们的自主性、创造性、协作精神和统筹能力，锻炼基本科学研究能力。同时也希望同学们本着对自己和实验小组负责的态度，认真投入时间和精力，尽力设计、筹划、实施所设计的实验内容，配合教师做好本次实验教学改革。由于初次尝试，在本实验课程时间安排、人员协调、内容衔接、仪器设备和场地提供等诸多方面都会出现不可预期的问题，还望同学们予以配合和谅解！2微生物实验室安全须知普通微生物学实验课程的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的良好作风。为了提高教学效果，保证实验质量和实验室安全，特提出如下注意事项：1．每次实验前必须对实验内容进行充分預习以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路淸楚。2．认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。3．实验室内应保持整洁，勿离声谈话和随便走动，保持室内安静。4．实验时要小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打玻、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。5．实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰，如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火，必要时用灭火。6．使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护，对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。7．每次实验完毕后，必须把所用仪器摆放妥当，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炎酸液覆盖0.5h后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间，凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须涂在3%来苏尔液中进行消毒。8．每次实验需进行培养的材料，应标明自己组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养，实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得捎出室外。9．每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入实验报告中，力求简明准确，认真回答思考题，并按时提交实验报告供教师批阅。10．离开实验室前将手洗干净，注意关闭仪器、水电、门窗和灯等。3微生物实验注意事项一、无菌操作要求1．接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。2．进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。3．进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。4．从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。5．接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。6．接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。7．吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。二、无菌间使用要求1．无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5~0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。2．无菌间内应保持清洁，工作后用2%~3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。3．无菌间使用前后应将门关紧，紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。4．处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。5．在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。4三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。（一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法1．灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。2．装放（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。（2）大型高压蒸汽锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。3．设备检查（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。（2）检查压力表蒸汽排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。（3）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。4．灭菌处理(1)干热灭菌法：此法适应于在干热情况下，不损坏、不变质、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。①器械器皿应清洗后再干烤，以防附着在表面的污物炭化。②灭菌时安放物品不能过挤，不要直接接触底和箱壁，物品之间留有空隙。③菌时将箱门关紧，接上电源，先将排气孔打开约30min，排除灭菌器中的冷空气，温度升至160℃调节指示灯，维持1.5~2h。④灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。(2)手提式高压锅或立式压力蒸汽灭菌器的使用应按下列步骤进行：①手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）.②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。③盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）。5④关闭排气阀，使蒸汽压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。⑤达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸汽，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。（二）间歇灭菌方法1．灭菌方法系利用不加压力的蒸汽灭菌，某些物质经高压蒸汽灭菌容易破坏，可用此法灭菌。(1)将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。(2)关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10-20min。(3)灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温