吗啡检测试纸条的

吗啡检测试纸条的制备•吗啡简介•吗啡试纸检测原理•生产工艺•市场现状•产品的改良创新•吗啡（Morphine）是一种精神科药物，分子化学式为C17H19NO3，分子量为285.34，以口服形式为主。因为吗啡具有梦境一般的镇痛效果，所以科学家就以希腊神话当中的梦境与睡眠之神——摩耳甫斯（Morpheus）的名称将这种麻醉式镇痛剂命名为“吗啡”（Morphine）。战争期间，军医经常使用为伤兵止痛。从吗啡提炼出来至今已有180年历史。吗啡是从植物罂粟中提取的，是鸦片中最主要的生物碱(含量约10-15%)。•药物作用原理作用于中枢神经与平滑肌，能改变神经对痛的感受性与反应性，而达到止痛效果。给药后分布于全身，但在肾、肝、肺中浓度较高。用途：为镇痛剂，可减轻末期癌症病患、大面积烧烫伤患者的痛苦而贡献良多。•（1）镇痛：有强大的镇痛作用，对一切疼痛均有效，对持续性钝痛比间断性锐痛及内脏绞痛效果强。1次给药，镇痛作用持续4～8小时，故仅用于创伤、手术、烧伤、心肌梗塞等引起的剧痛。•（2）镇静：在镇痛的同时有明显镇静作用，有时产生欣快感，可改善疼痛病人的紧张情绪。•（3）抑制呼吸：可抑制呼吸中枢，降低呼吸中枢对二氧化碳的敏感性。•（4）镇咳：可抑制咳嗽中枢，产生镇咳作用。因有成瘾性，并不适用于临床。•（5）对平滑肌的作用：可使消化道平滑肌兴奋，致使便秘；并使胆道、输尿管、支气管平滑肌张力增加。•（6）心血管系统：可促进内源性组胺的释放而使外周血管扩张、血压下降；使脑血管扩张，颅压增高。•（7）镇吐：亦因有成瘾性而不适用于临床。注意事项•具有成瘾性，不能超量使用，一定要依医生所指定的剂量服用。•虽然吗啡具有一定成瘾性，但是该使用时还是要依照医师建议使用，以免强烈疼痛造成更危险的副作用。•服药后勿抽烟，没有扶助时勿走动。•有生理赖药性时，突然停药会有成瘾症状。在停药36～72小时后，达到高峰，其症状包括打哈欠、流泪、流鼻水、打喷嚏、瞳孔放大、肌肉颤抖、头痛、出汗、恶心、呕吐、焦虑、失眠、腹泻、脱水、心跳加速及体重减轻等。•中毒处理：立即以其拮抗剂纳洛酮注射剂400μg解毒。必要时重复给药。儿童解毒剂量之计算以每kg体重5—10μg为•基本原理：利用细胞融合技术制备了抗吗啡特异性单克隆抗体（mAb），并将这些抗体与某些合适的标记物连接，利用免疫学检测技术的方法对样品检测。检测样品的选取•人体中的一些体液如唾液、血液(血清或血浆)、尿液、汗液以及毛发都可以作为检测阿片类药物滥用的样品。头发作为样品需要很复杂的前处理,因此不适合作为快速检测的样品。•尿样相对唾液和血液样品的优点在于高吗啡浓度,这就降低了检测难度,减小了检测产品开发的难度,因此目前很多检测产品或方法都是以尿样作为检测样品的。•唾液的优点在于样品的采集,但是由于唾液中吗啡浓度较低,需要较高灵敏度的检测方法对其进行分析。􀇡􀇡􀇡􀇡吗啡检测的方法•①高效液相色谱法•②气相色谱一质谱法•③放射免疫分析法•④免疫荧光技术•⑤免疫酶技术•⑥胶体金免疫层析技术•高效液相色谱法(HPLC)是一种对阿片类药物进行准确定性和定量检测的有效检测手段。对于阿片类药物的吗啡检测方法,国际上多数国家药典曾一直采用石灰法,该法取样多,操作复杂,耗时长,而且方法科学性较差,与现代分析方法要求快速、准确、可靠的距离相去甚远•气相色谱一质谱法技术在药物滥用检测中的应用较为广泛。气相色谱一质谱法是目前国际上公认的最后确证毒品的定性、定量的有效手段之一，其检测结果具有权威性，国际上常用的兴奋剂检测也是采用此法的。•放射免疫测定法是最早建立的经典的免疫分析方法，检测的准确度较高,检测限低,样品用量少,且不需要作预处理。因此用于检测血液中的吗啡含量具有特殊的意义。血液中的吗啡主要与血红蛋白结合，通过提取，用其他方法检测灵敏度往往不够，由于放射免疫法的高灵敏性，可以直接检测血液中的微量吗啡。•免疫荧光标记技术始创于20世纪40年代初1942年coons等首次报道用异氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。•免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化作用相结合，由此建立的一种非放射性标记免疫检测技术。•此项技术最初是作为免疫组织化学的一种新型染色方法，其原理和操作程序与荧光抗体技术相似。不同的是用酶代替荧光素作为标记物，并以底物被酶分解后的显色反应进行抗原或抗体的示踪。方法弊端•尿液中吗啡浓度的测定中，单克隆抗体单片定性法,薄层层析色谱法，气质联用法,这些方法都不同程度干扰大，有交叉反应和较复杂的前处理过程等弊端。•酶免疫定量检测法需要较复杂的仪器,耗时长，不适宜快速检测的要求。基本原理•胶体金免疫层析技术（GICA）：是在免疫层析的基础上建立的一种简单快速的免疫学检测技术这种方法灵敏度高,特异性强,稳定性好,操作简便快速,分析结果准确且易于判定,特别适用于吗啡现场的快速筛选监测分析。可利用此原理制备试纸•尿样中吗啡的检测:将牛血清白蛋白-吗啡交联物和羊抗小鼠IgG分别画线于硝酸纤维膜上,作为样品检验区和质控区将纯化后的胶体金颗粒附着于玻璃纤维滤纸上，并固定于硝酸纤维素膜的下端,然后可用制成的试纸对样品进行检测。(目前市面上已经存在尿样吗啡胶体金免疫层析试纸条,但是对于唾液胶体金免疫层析试纸条研制的报道还是很少.)•胶体金免疫层析试纸条通常有双抗体夹心和竞争法两种形式，由于吗啡为小分子物质只有单一抗原决定簇和位阻的原因，因此利用竞争胶体金免疫层析法研制吗啡胶体金免疫层析试纸条进行检测。•在硝酸纤维膜上等距离喷涂抗原和二抗线，分别为抗原（T线）、羊抗鼠IgG（C线），在玻璃纤维膜上喷涂有胶体金标记的吗啡单抗。试纸反应原理在胶体金竞争法免疫层析（可以根据胶体金标记对象的不同分成抗体金标型和抗原金标型），将样品液滴加到样品垫上后，受毛细作用力向金标垫层析，随后胶体金标记物复溶于溶液中并随溶液一起向T线移动。若样品液中没有被分析物即吗啡，则胶体金标记物与T线上蛋白特异性结合形成线条,即阴性。若样品中有被分析物吗啡,在抗体金标型中,小分子物质与T线上的抗原竞争结合胶体金上的抗体,在抗原金标中,小分子物质与胶体金上的抗原竞争结合T线上的抗体,这两种情况都使得金标记物不能和T线上物质结合,从而不能产生线条,即阳性原料生产•(1)胶体金的制备一般来说,所有的生产方法是使用还原剂提供电子给溶液中的正价金离子而生成金原子。根据这个理论，通常使用的还原剂包括柠檬酸三钠、白磷、硼氢化纳、鞣酸、硫氟酸钠等。以下是一些常用的方法。􀇡•1.柠檬酸三钠还原法•2.鞣酸-柠檬酸三钠•3.自磷还原法（2）胶体金颗粒大小的选择•胶体金颗粒大小的选择摇按常规方法，用氯金酸和柠檬酸三钠溶液配制胶体金溶液，根据所加入的还原剂柠檬酸三钠量的不同，制备出不同大小颗粒的胶体金溶液。•(3)牛血清白蛋白-吗啡(BSA-MOR)免疫抗原的合成（交联物）为什么要制备抗原？•用琥珀酸酐将半抗原吗啡和载体蛋白BSA偶联,形成抗原BSA-MHS-MOR􀇡免疫抗原。􀇡􀇡􀇡􀇡􀇡􀇡􀇡􀇡􀇡􀇡•具体如下:将0.1mol吗啡溶于二甲基甲酰胺(DMF)中,在加入25mg琥珀酸酐,室温下搅拌反应12h在加入50ul三乙胺,继续反应6小时。再往溶液中加入180ul三丁胺和140ul氯甲酸异丁酯。在4℃下反应2h为反应液A液。将75mg溶于6ml50%氧六环中,调ph至9,在4℃下保存为B液。将A液逐滴滴入B液中,调PH至7左右4度下反应6h。在4℃下透析。•􀇡为什么要合成抗原？•我们学过免疫的原理：当外界抗原进入体内后，人体免疫系统就会对进入的抗原如细菌、病毒、异己大蛋白等产生免疫反应，并产生特异性的抗体，以保护机体不被感染。但当抗原分子很小，甚至是化合物时，则本身不能刺激免疫系统产生抗体，也就不能形成抗原，抗体反应。我们需要检测的毒品就是不同形式的化合物。•所以为了进行毒品的免疫学检测方法，首先就要得到特异性的毒品抗体，并且能建立抗原，抗体的反应系统。由于毒品本身是分子量很小的化合物，本身并不能刺激免疫系统产生抗体，也不能形成抗原，抗体反应，因此需要将毒品与大蛋白质分子联接起来，形成蛋白交联体，同时保留毒品结构的特性，这样可以形成完整抗原结构，完成免疫反应。（最常用的交联物为大分子蛋白质。其中包括牛血清白蛋白BSA牛甲状腺球蛋白BTG卵清蛋白OVA等)•（4）抗吗啡单克隆抗体的制备•取BSA-MOR稀释于生理盐水中共0.3ml，加等量福氏完全佐剂充分乳化后，腹腔注射0.2ml/只,共免疫3只。14d后，取75ugBSA-MOR交联物，加福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射四免后取免疫小鼠尾静脉血进行效价测定。同时做小分子的竞争实验，效价达到1：32万血清竞争达到1000ng，即可小鼠尾静脉注射加强免疫，3d后常规融合，包被MOR-TG交联物（1mg/L）以间接ELISA方法进行筛选，取阳性孔且有竞争的克隆孔以有限稀释法进行克隆化。阳性率达到100%后，扩大培养收集细胞注射小鼠腹腔7d后收集腹水。(5)抗吗啡单克隆抗体的鉴定•取制备的腹水进行抗体鉴定。•①效价测定：采用间接ELISA法。•②Ig亚类的鉴定。•③特异性鉴定：利用吗啡小分子进行竞争实验,根据ELISA效价1.0的稀释度把抗体做稀释，将小分子依次做梯度100mg/L、200mg/L、300mg/L、500mg/L、1000mg/L间接ELISA检测。实验中以稀释抗体作为对照。（6）吗啡胶体金交联物的制备及鉴定•将腹水以饱和硫酸铵沉淀过夜透析后，做蛋白A亲和层析，测定含量。将纯化的mAb与胶体金颗粒交联，并以超速离心法化。（7）试纸的组装•将金胶体金（即制成的金标垫），样品垫，吸水垫，粘胶纸组装到免疫硝酸纤维素膜上。同时将上步制备的吗啡胶体金交联物和羊抗小鼠IgG抗体分别画线于硝酸纤维素膜上，作为样品检验区和质控区。这样就制备好了吗啡的检测试纸条。测试过程及结果分析•当尿液不含有吗啡时，红色的胶体金-吗啡抗体复合物随尿液从膜上流过，膜上的吗啡与它结合，在检测区形成红色带，这时检测结果为阴性。•当尿液中含吗啡时，尿液中的吗啡与膜上的吗啡竞争胶体金原吗啡抗体复合物，当尿液中的吗啡含量达到一定浓度时，抗体与尿液中吗啡抗原完全结合，致使胶体金原吗啡抗体复合物无法在膜上滞留，检测区不能形成红色带，这时检测结果为阳性。市场现状•随着吗啡快速检测试剂市场竞争的愈发激烈，其企业数量增幅不大。•2003-2009年行业企业数量发展状况•但这并不代表其发展前景不好，相反，根据调查，其需求量是逐步增加的。•能否经受住市场各种竞争的压力，这点尤为重要。这图反映市场压力的来源。•因此，要想使企业具备市场竞争力，就要不断改善技术工艺，领先于竞争者。随着我国吗啡快速检测试剂市场的迅猛发展，与之相关的核心生产技术应用与研发必将成为业内企业关注的焦点。了解国内外吗啡快速检测试剂生产核心技术的研发动向、工艺设备、技术应用及趋势对于企业提升产品技术规格，提高市场竞争力十分关键。创新改良•由于尿液检查的不便，可以改良创新利用唾液进行检测。•目前，用于检测毒品的胶体金免疫层析试纸条大都是以尿液作为检测样本的，虽然尿液中的毒品浓度较高，不需要很高灵敏度的检测方法，然而，吸食毒品1天内尿液中的吗啡水平很低，不能用试纸条检测，而且尿液样本收集不方便，这使得尿液试纸条在实际应用检测中存在很多问题。•唾液作为样本则更加容易收集，且在吸食毒品之后几小时之后就有一定的吗啡浓度。而且快速，方便，市场前景大。•基于上述情况主要研究制备用唾液或是用唾液尿液联合检测吗啡的胶体金免疫层析试纸条。研究用大分子蛋白偶联吗啡制备吗啡抗原并用其免疫制备得到抗吗啡单克隆抗体用于胶体金免疫层析试纸条制备。•寻求最优的抗原、单抗和二抗浓度，并优化蛋白质在NC膜包被条件,最终成功研制了不同灵敏度的唾液及尿液检测吗啡的胶体金免疫层析试纸条。（2）•在胶体金免疫层析技术中，一些药物在一定浓度时会干扰此试验,观察结果时应结合临床用药情况综合判断.所以在抗干扰上进行