食品检验-糖

糖分析检测1单糖的结构基础知识•糖的表示式CH2OHCHOCHOCH3CHOCH2OHOCHOCH2OHD-木糖L-鼠李糖D-葡萄糖D-果糖五碳醛糖甲基五碳醛糖六碳醛糖六碳酮糖CHOCH2OHOD-葡萄糖~2单糖是多羟基醛或酮。从3碳糖至8碳糖天然界都有存在。每个糖都有两个以上的手性碳原子，它们的命名规则是：碳原子的排列顺序是从醛基或者酮基基团为C-1开始的。单糖在水溶液中形成半缩醛环状结构，即成呋喃糖和吡喃糖。具有六元环结构的糖——吡喃糖（pyranose）具有五元环结构的糖——呋喃糖（furanose）糖处游离状态时用Fischer式表示，苷化后成环用Haworth式表示单糖的结构基础知识•醛糖和酮糖甘油醛和二羟基丙酮有相同的化学组成，C3H6O3，但是不同的结构，它们属于结构异构体。CCCH2OHHOOHHCCCH2OHHOHHOmirrorplanL-glyceraldehydeD-glyceraldehyde3CCHOHCH2OHOHGlyceraldehyde(analdose)C3H6O3CH2OHCCH2OHDihydroxyacetone(anketose)C3H6O3O立体异构甘油醛有一个不对成碳原子（手性碳原子），所以它有两个立体异构体，即D-和L-型。并且互为镜像异构体。单糖的结构基础知识•Fischer与Haworth的转换及其相对构型CHOCH2OHOOCCH2OHHOHOCCH2OHOHHOD-葡萄糖异侧同侧αβ异侧同侧4单糖成环后新形成的一个不对称碳原子称为端基碳（anomericcarbon）。生成的一对差向异构体（anomer）有α、β二种构型。从Fischer式看（C1与C5的相对构型）：C1-OH与原C5（六碳糖）或C4（五碳糖）-OH，顺式为α，反式为β。从Haworth式看：C1-OH与C5（或C4）上取代基之间的关系：同侧为β，异侧为α。单糖的结构基础知识OCCH2OHOHHCHOCHOCH2OHCHOCH3CH3Oα-OH甘油醛D型D-葡萄糖L-鼠李糖β-D-葡萄糖α-L-鼠李糖5糖的绝对构型（D、L）绝对构型D-和L-的判断是从醛基或者酮基开始最远的手性碳原子。Fischer式中最后第二个碳原子上-OH向右的为D型，向左的为L型。Haworth式中C5向上为D型，向下为L型。单糖的结构基础知识•环的构象OOO1234(2)(3)(4)(5)OOC1式1C式12345123456呋喃糖五元环接近在同一平面上。唯醛糖的C3、酮糖的C4超出平面0.5A，几乎是固定的结构。六元环有船式和椅式构象，在溶液或固体状态是都是椅式构象，不是C1便是1C。[C表示椅式（chairform）]。以C2、C3、C5、O四个原子构成的平面为准，C4处面上，C1处面下的标为4C1，简称C1，反之1C4简称1C。Angyal用总自由能来分析构象式的稳定性，比较二种构象式的总自由能差值，能量低的是优势构象。多糖研究的基本步骤1、多糖链的释放、提取（水提、碱解、酶解、碱解结合酶解）2、多糖的分离纯化（蛋白质去除、脱色素、小分子杂质、凝胶柱色谱、离子交换柱色谱、分级沉淀）3、多糖纯度检测（UV、凝胶过滤、电泳、HPLC)4、多糖一级结构的测定（糖基组成、连接方式、分子量、异头碳构型、分支等）7糖分析常用方法：化学法–部分和完全酸水解、乙酰解、甲醇解（水解成单糖）–高碘酸氧化、Smith降解(糖苷键位置，单糖组成和分子比例，聚合度、分支)–甲基化分析（糖苷键位置，包括分支点、单糖组成和分子比例）生物法–酶法（糖基连接次序，-/-异头体）色谱法-PC,TLC（单糖组成）-HPLC和GC（单糖组成和分子比例，定量分析）波谱法–UV（纯度检查）–IR（-/-异头体、吡喃环/呋喃环）–MS（分子量等）–NMR（-/-异头体、糖基连接次序）8多糖分析方法•1.单糖组成分析•2.糖苷键链接分析•3.异构体分析•4.多糖分子量的测定•5.糖的连接顺序•6.保健食品中多糖的定性定量测定方法9水解：多糖水解成单糖。完全酸水解：多糖与强酸（浓硫酸、浓盐酸）在（80-100℃）水解4-10h。操作：取样20mg，加0.5-1mol/L硫酸溶液２ml，充氮除氧封管，在１００℃水解１0小时，水解液用碳酸钡中和，离心过滤，滤液备用。或20mol／L三氟醋酸（TFA），120℃恒温lh，或2moI／LTFA，100℃恒温6h。部分酸水解：0.02mol/LHCl,多糖链上呋喃糖苷键、位于末端的糖苷键和支链上的糖苷键易水解特性。水解后，醇析、离心，将上清液和沉淀分别进行分析。乙酰解：将多糖与乙酐、冰醋酸、浓硫酸等混合反应，可得到乙酰化单糖，用于单糖组成分析。甲醇解：多糖与HCl-CH3OH混合反应，半缩醛甲基化，减少异构物，有利分辨。1、单糖组分的确定:101)纸层析(Paperchromatography,PC)：滤液与标准品同时点于滤纸上，展开剂展开后，显色，根据样品和标准品的Rf值和斑点颜色进行鉴定。溶剂系统被分离的混合物乙酸乙酯：吡啶：水（2：1：2）乙酸乙酯：乙酸：水（3：1：3）木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖正丁醇：乙酸：水（4：1：5）葡萄糖，半乳糖，甘露糖，木糖，L-岩藻糖，葡萄糖醛酸，氨基葡萄糖及氨基半乳糖正丁醇：吡啶：水（6：4：3）鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等★11苯胺-二苯胺显色剂：80℃、10min,醛糖显蓝、蓝紫色或蓝绿色，酮糖呈棕色，检出限量为10ug。苯胺-邻苯二甲酸显色剂：105℃、5-10min,戊糖显鲜红色,巳醛糖及糖醛酸为棕色,在紫外光下有荧光,而一般戊糖则无荧光,可用来区别戊糖及巳糖,氨基葡萄糖呈浅棕斑点,紫外下呈黄绿色荧光，灵敏度为1ug。12２）薄层层析（ThinLayerChromatography，TLC)：硅胶（常用0.1mol/L磷酸二氢钠溶液调配）。水解后薄层检测：先将样品酸水解后，点样展开检测。薄层酸水解检测:将点有待测样品的高效薄层板在12N盐酸蒸气中60C水解40min，取出薄层板待酸挥发干以后，将标准品点于同一块板上，然后置于层析缸内展开，吹干展开剂后喷糖显色剂，与标准品进行对照。13苦豆子胶多糖组分的薄层色谱图1、甘露糖2、半乳糖3、混合标准单糖4、苦豆子胶多糖水解物例：食品研究与开发2006，27（11）：16114３）HPLC法：A:直接HPLC法：用HRC-NH2色谱柱，乙腈-水（７5：25）为流动相，示差检测器。面积归一法，还可计算各组分百分含量。B:柱前衍生化HPLC法：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化HPLC测定单糖含量，PMP是最好衍生化试剂之一，衍生物不易裂解，分析时不产生异构峰，且在250nm处有强烈的紫外吸收。（C18）15例：标准单糖HPLC图谱库拉索芦荟多糖水解衍生物的HPLC图谱木立芦荟多糖水解衍生物的HPLC图谱食品科学，2006，27：194164)气相色谱法（GasChromatography,GC)或GC-MS法：先衍生化成硅烷化衍生物，GC分离后检测糖的组分及摩尔比。可与MS联用GC-MS。凡是能够气化且稳定、不具腐蚀性的液体或气体，都可用气相色谱法分析。有的化合物沸点过高难以气化或热不稳定而分解，则可通过化学衍生化的方法，使其转变成易气化或热稳定的物质后再进行分析。局限性：不适于高沸点、难挥发、热稳定性差的高分子化合物和生物大分子化合物分析。17例：混合标准单糖衍生化GC图谱白芷多糖水解衍生化产物GC图谱18１）高碘酸氧化法：可以选择性断裂糖分子中邻二羟基和邻三羟基处,生成相应的多糖醛、甲酸(或甲醛),反应定量进行，每开裂一个C-C键消耗一分子高碘酸。如,1,2-,1,4-,1,6-糖苷键能够反应，而1,3-糖苷键的则不能，且不同位置的缩合，高碘酸的消耗量和甲酸生成量不同，用氢氧化钠滴定甲酸的量,可以判断糖苷键位置、直链多糖聚合度、支链多糖的分支数目等。1,3-不消耗高碘酸1,2-；1,4-消耗1mol高碘酸1,6-消耗2mol高碘酸,生成1mol甲酸操作:一般取25mg样品,溶于20mmol／L高碘酸钠溶液50ml中,在５-１5度暗处氧化14天，取25ml加乙二醇１ml,用0.12mol/L氢氧化钠溶液滴定，以测定甲酸的生成量。2、糖苷键连接位置的测定：191-2糖苷键1-3糖苷键２）Smith降解法：是过碘酸氧化的改良反应，即在高碘酸氧化后，NaBH4还原，再用弱酸部分水解。水解液中和后，纸色谱法分离鉴定，以确定糖苷键的连接位置，若有葡萄糖检出，肯定有１,３-糖苷缩合。201-4糖苷键1-6糖苷键213）甲基化分析：羟基的全甲基化：强碱条件下（使糖基的自由羟基离子化，生成稳定的碳阴离子），与碘甲烷(或硫酸二甲酯，三甲基氯硅烷)作用，甲基化化生成甲醚。甲基化产物的水解、还原、乙酰化：酸水解（90%甲酸）得到甲基化单糖，再经NaBH4还原为对碱稳定的糖醇，然后用乙酸酐在吡啶中乙酰化，得到各种部分甲基化的糖醇乙酰衍生物。GC和GC-MS分析：与标准谱图归属比较，可确定单糖组分的种类、比例和糖苷键的位置。异头碳糖苷键构型、糖基顺序无法确定。224）酶法①内切糖苷酶F（天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺糖苷酶）②内切糖苷酶H（β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶）③唾液酸酶④α-半乳糖苷酶⑤β-N-乙酰氨基己糖糖苷酶⑥α-甘露糖苷酶⑦β-甘露糖苷酶23１）红外光谱（infraredspectrograph，IR）法：红外光谱法是一种专属性很强、应用较广（固体、液体、气体样品）的鉴别方法。在800nm-20um连续光扫描记录下来的图谱。原理：由分子的振动及转动能级跃迁而引起的。３、异头体的测定：24异头体类型：型糖苷键在８９０cm-1左右处有特征吸收；型糖苷键在８４０cm-1处有特征吸收。呋喃糖和吡喃糖：呋喃糖在924±13，879±7cm-1，吡喃糖相应在917±13，770±14cm-1处。吡喃糖种类：-D-葡萄吡喃糖特征吸收在855833cm-1处，-D-葡萄吡喃糖905876cm-1。磷酸基、磺酸基等取代基团信息IR能给的糖结构信息：25２）核磁共振（NuclearMagneticResonance,NMR）法：1H-NMR中:C1质子信号小于5ppm，为型，如4.53信号为型糖苷键；型糖苷键常大于5ppm，常在5.4-5.1ppm。13C-NMR中:型C1:103-105ppm,型97-101ppm.3）酶法：酶促反应的高度专一性，利用糖苷酶，糖苷酶对多糖底物的催化反应，可确认多糖糖苷键类型。26多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项重要工作。多糖的理化性质及活性与多糖的分子量及其分布有关，如右旋糖酐：分子量为10万-20万时能使血液中红细胞聚集，而分子量为2万-4万时，不但不使红细胞聚集，反而使已聚集的红细胞解聚，所以不同分子量的右旋糖酐在临床上有完全不同的应用。又如低分子肝素（4000-6000）：抗血栓药物；而普通肝素（3000-40000）用于抗凝血。多糖类药物的分子量及其分布的测定，在确保生产工艺的稳定性以及临床用药的安全有效性方面，显得尤为重要。4、多糖分子量的测定：27数均和重均分子量：（Numberaverageandweightaveragemolecularweight）对于多糖来说，其分子链的长短可以是一个混合物，在衡量其分子量时，往往是一个平均数。数均分子量就是依据总体分子的个数，求出分子量来的，如应用化学方法和渗透压方法测定的即为数均分子量。重均分子量就是依据各个分子的重量求出的分子量，如沉降方法，扩散方法，光散射方法测得的分子量属于重均分子量。按照理论计算，如果重均分子量和数均分子量数值相等，这生物大分子样品属于均一的样品，如果重均分子量大于数均分子量，则这生物大分子样品为混合品。混合品一定是重均分子量大于数均分子量，倒过来是不可能的。因此数均分子量与重均分子量之差，是衡量样品是否均一的标志。D=Mw/Mn