微生物实验报告

微生物实验报告第一模块报告人：学号：实验时间：概要：微生物在自然界是分布最广、种类最多的一类生物物种；无论在万米的高空，还是在万米的深海，或是高原冻土，抑或是极地冰心，火山喷发地域、盐湖、热泉等都能寻找到它们的踪迹；可以这么说，微生物的生存环境涵盖了地球上的所有生物。由于这些微生物个体微小、造型简单和肉眼难以观察到，因此，人们往往忽略了它们的存在，而这些微生物又常是引起工厂、医院和微生物学实验室中各种实验材料、实验菌种、产品和手术创口等污染的祸根。所以研究微生物的多样性、识别菌种种类、掌握无菌操作技术具有相当大的现实意义。本论文分为四个实验，它包括：环境微生物的采集与观察、细菌的形态特征观察与鉴定、放线菌与真菌的形态特征观察与鉴定、环境中噬菌体的分离与纯化。我们通过对土壤和水库中的微生物的采集，获得一系列不同种类的微生物，然后对得到的微生物进行选择培养和纯化，分离出细菌、放线菌、真菌、噬菌体等，再对其进行进一步的观察和研究，从而了解各种微生物的基本形态特征、结构特点及生活环境对其生长的影响等。同时通过自己动手，我们的实验操作技术得到强化，掌握了光学显微镜的基本操作、无菌操作技术及染色、培养、分离和计数等微生物实验的基本操作方法。关键词多样性分离纯化形态特征无菌操作培养实验目的1.树立严格的无菌意识和掌握正确的无菌操作方法。2.了解光学显微镜显微观察的基本操作和油镜头的使用方法及微生物的稀释涂布分离方法与技术3.学习观察细菌、放线菌以及霉菌的群体形态及培养特征；4.了解革兰氏染色原理，掌握革兰氏染色技术；5.熟悉细菌芽孢和荚膜的染色方法；6.初步学习平板菌落计数以及活菌检测的方法7.初步掌握平板菌落转接平板及固体斜面的菌种纯化方法8.掌握观察放线菌和丝状真菌以及酵母菌显微结构及菌落的基本方法9.掌握测定微生物细胞大小的测微技术和单细胞微生物进行显微直接计数的方法。10.了解从环境污水中分离噬菌体的普通原理11.熟悉并掌握噬菌体的扩增、培养与检测的实验方法和噬菌斑效价的测定方法。实验原理自然环境中的微生物都是混居形式的，并且不同的环境下具有不同的微生物类群和区系，不同的微生物具有不同的营养需求和生长条件，通过不同的培养基和适当的分离方法就可以将混居形式存在的各种微生物分离开来并得到它们的纯系。不同的微生物在一定的培养条件下所形成的平板菌落各具有某些对应的形态特征，这些特征可以用来初步区分各大类群的微生物以及分类鉴定中的初步识别。这些形态特征包括个体形态与群体形态，个体形态主要通过显微镜及染色技术来辨别，群体形态则通过单个微生物细胞在固体培养基上形成的菌落来认识，包括大小、颜色、边缘、质地、表面形貌、湿润或干燥、光滑或褶皱、是否隆起是否产生色素等。例如放线菌和霉菌都具有比较发达的分枝菌丝。在比较它们的形态结构时通常采用盖玻片插片培养法。而对噬菌体来说由于细菌病毒侵染细菌细胞，导致寄主细胞溶解死亡，因而在琼脂培养基表面形成的空斑。我们可以通过培养基上的空斑来计量噬菌体来计算其价效。实验内容和方法一、实验一环境微生物采集与分离一、实验目的1.了解环境与微生物的关系及其多样性；2.学习环境微生物（土壤、水体、人体等）采样的基本方法；3.初步掌握观察微生物的实验方法；4.了解光学显微镜显微观察的基本操作和油镜头的使用方法；5.了解并熟悉微生物的稀释涂布分离方法与技术；6.树立严格的无菌意识和掌握正确的无菌操作方法。实验器材1．采样器材：无菌牛皮纸袋、无菌取水容器、灭菌金属勺、无菌棉签；2．培养基:牛肉膏蛋白胨平板，高氏一号培养基平板，马铃薯葡萄糖平板；3．无菌水（三角瓶与试管）,玻璃吸管，手动加样器，悬滴载玻片，普通载玻片，接种环，玻璃三角涂棒，酒精灯，沙黄或结晶紫染液。二、实验内容与方法（一）天然环境微生物样品的采集、分离、培养1.环境微生物样品采集空气中微生物采集：牛肉膏蛋白胨平板（单组）和马铃薯培养基（双组），打开皿盖在空气中暴露5min后盖上皿盖（室外和室内各一个）。土壤微生物采集：五点对角取样，混匀，称取1克土壤放入含9ml无菌水的三角瓶中（内含玻璃珠数粒），振荡分散。水体微生物采集与稀释：用灭菌三角瓶分别取污水和水库水约10ml。2.样品稀释土壤微生物样品的稀释：2克土壤放入含18ml无菌水的三角瓶中（内含玻璃珠数粒），混匀后用加样枪和枪头在离心管中进行10倍比稀释成10-2,10-3的梯度样品。水体微生物样品的稀释：将污水和洁净水,分别稀释成10-1,10-2,10-3等系列。3.样品的平板稀释涂布微量加样枪分别取100μl含菌液体放于固体培养基平板表面中央，用无菌的玻璃涂棒将样品液滴均匀涂布分散在平板表面。土壤样液：10-2,10-3样液（单号组10-2，双号组10-3）1牛肉膏蛋白胨培养基1高氏一号培养基1马铃薯培养基水体样液：库水:10-1，10-2,污水:10-2,10-3样液（单号组库水，双号组污水）2牛肉膏蛋白胨培养基4.培养将平板倒置放入培养箱内进行培养。牛肉膏蛋白胨培养基：30℃24hr下周每个班提前一天课前半小时转接斜面,培养高氏一号培养基：28℃1week马铃薯培养基上：28℃1week(三）口腔微生物的观察1.取样：用无菌棉签在口腔内反复擦拭几遍，然后将棉签涂布于载玻片上(事先放1/3滴水)。2.制片(单染色法)涂片→固定→沙黄染色2分钟→水洗至无色流液→吸去残留水→酒精灯干燥。3.显微镜油镜观察：按照低倍-高倍-油镜的顺序进行观察。油镜镜头的使用光源亮度适中，光圈75%左右，聚光镜调节至顶，干燥样品上滴加少许香柏油，用100×镜头对准光路，用显微镜粗调将镜头与样品表面相接，然后用细调往与粗调相反方向调节直至出现清晰的影像。油镜清洗：擦镜纸擦去镜头上的油，擦镜纸沾取二甲苯擦拭镜头，干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。实验一总结一.移液枪的正确使用二.养成良好的无菌操作的意识1.涉及到的实验材料要灭菌(水、枪头、涂棒、接种环等）；2.手要用75%的酒精擦拭；3.尽量靠近在酒精灯边操作。三.稀释涂布操作：1.涂棒灭菌和冷却；2.涂布要均匀四.人体微生物的采集和观察1.涂片要薄而均匀；2.固定温度不能高，以免影响细胞形态；3.染色后水洗要轻。五.显微镜的使用：油镜的正确使用六.菌种的转接思考转接失败的原因有哪些？实验二细菌的形态特征观察与鉴定一、实验目的1.学习观察细菌、放线菌以及霉菌的群体形态及培养特征；2.了解革兰氏染色原理，掌握革兰氏染色技术；3.熟悉细菌芽孢和荚膜的染色方法；4.初步掌握平板菌落转接平板及固体斜面的菌种纯化方法;5.初步学习平板菌落计数以及活菌检测的方法二、实验原理和内容菌种的活化转接（提前24小时完成）革兰氏染色法、芽孢染色法、荚膜染色法等。霉菌放线菌插片制备细菌、放线菌与霉菌的平板菌落特征观察三、实验材料大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、自备未知细菌斜面（24h培养物）硅酸盐细菌7天液体培养物革兰氏染色液一套、黑色素、碱性品红染液、显微镜等四、实验步骤革兰氏（Gram）染色法1.涂片2.初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。5.复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：观察染色结果并绘图。2细菌的荚膜染色1)制片与染色：无菌操作挑取一环硅酸盐细菌的液体培养物在载玻片上涂抹均匀，并使其自然干燥。首先用碱性复红进行初染3分钟，洗去多余染液。然后在载玻片的另一个区域滴加一滴印度墨汁，用另一块干净的载玻片的短边将墨汁推向细菌样品液滴直至推到第一块载玻片的末端为止，以形成一个均匀的墨汁与样品混合的推片，在空气中自然干燥或者用吹风机的冷风将其吹干。2)镜检：先高倍后油镜的顺序观察染色样品，可以观察到不被着色的荚膜形态。细菌荚膜的观察光学显微镜下的细菌鞭毛放线菌与霉菌菌落的平板划线转接及盖片插片培养首先在一个新鲜高氏一号平板的底部用记号笔将平板一分为二，选取实验一的高氏一号培养基上放线菌得到良好分离的平板，用无菌接种环挑取2个不同形态放线菌菌落分别划线接种于新鲜的高氏平板的两个区域，然后用无菌眼科镊以每个区域5-6片的数量将无菌盖玻片分别以45度角插入培养基上的划线轨迹约3-4mm，放入28℃正置培养，作为下一个实验的材料。做霉菌划线转接，平板选择马铃薯培养基，方法同上五、实验结果1.将观察到的革兰氏染色结果，芽孢，鞭毛与荚膜的形态进行绘图。3.描述你所观察到的细菌、放线菌和真菌的平板菌落的形态特征区别。4.将环境样品分离的微生物平板进行计数并填入表格中，最后计算水体样品和土壤样品的活菌数。空气环境微生物计数空气采集地点平板暴露时间平板细菌菌落计数仙林植物园空地微生物学教学实验室水体环境微生物计数实验二总结1.能熟练地使用显微镜。2.群落形态多样性：四大类微生物菌落的主要特征3.个体形态的观察:革兰氏染色出错的原因?实验三放线菌与真菌的显微形态特征观察以及酵母细胞的大小测量和计数一、实验目的1.掌握观察放线菌和丝状真菌以及酵母菌显微结构的基本方法；2.了解上述三类微生物的群落特征与细胞结构上的区别；3.掌握测定微生物细胞大小的测微技术；4.掌握对单细胞微生物进行显微直接计数的方法。二、实验器材1.光学显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板，血盖片，载玻片2.实验二插片培养的放线菌平板与霉菌平板3.实验标准菌种：曲霉、青霉、根霉示范片、酿酒酵母悬液三、实验内容与方法(一)放线菌形态的显微观察使用眼科镊将实验二的高氏一号平板中的盖玻片夹起放置于一块干净的载玻片上，然后用高倍镜对插片培养基界面以下的营养菌丝以及培养基界面以上的气生菌丝与孢子丝的形态进行观察，如果孢子丝具有螺旋，注意孢子丝的螺旋方向以及其它形态指标，这是放线菌的分类鉴定依据之一。分离的放线菌与实验提供的标准链霉菌同时进行观察，以比较异同。组间相互交流，比较观察结果的异同，进一步认识微生物多样性。放线菌的显微形态(二）霉菌形态的显微观察使用刀片和眼科镊将实验二的马铃薯平板中的小块培养基带盖玻片夹起放置于一块干净的载玻片上，然后用显微镜的高倍镜对插片培养基界面上下的霉菌菌丝结构以及子实体形态进行观察。注意不同霉菌的菌丝分化结构以及子实体的差别。如菌丝有无横隔，足细胞，假根，孢囊梗，分生孢子梗，孢囊，顶囊，帚状枝以及分生孢子形状等。并且将自土壤分离的霉菌与实验室提供的标准霉菌进行比较观察以发现差异。不同霉菌的菌落形态与颜色根霉Rhizopus曲霉Aspergillus青霉Penicillium黑曲霉构巢曲霉黄曲霉(三)显微镜测微技术以及酵母细胞形态的观察显微测微尺包括目镜测微尺和镜台测微尺。测量时须将其配合使用可达到测量的目的。目镜测微尺为一圆形玻片，玻片中央有一横线刻有大小格的等距离线。物镜测微尺为一特制的玻片，中央圆圈内有一个1毫米（mm）长分为100个等距离小格的刻线，每一个小格即为10微米（µm）。2.酵母细胞大小的测量移去镜台测微尺，将酵母细胞悬液滴加于干净载玻片上，加盖一块盖玻片做成水浸片，放置显微镜下用高倍镜对酵母细胞的长轴和短轴进行测量，或者对酵母细胞的直径进行测量。共测量5个，最后取其平均值作为结果填入实验报告。注意观察酵母细胞的形态特征（芽痕、液泡等）。血球计数板图示酵母细胞测微结果记录目镜测微尺标定结果：40×镜下倍目镜测微尺每格长度是μm.酵母菌号酵母的直径大小测定结果目镜测微尺格数实际直径/µm12345均值酵母细胞计数结果将显微计数结果记录于下表中。T表示五个中方格中的总菌数；D表示菌液稀释倍数。各中格中菌数TD二室平均值个/ml12345第一室第二室实验四污水中大肠杆菌噬菌体的分离、纯化与观察一.实验原理噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。①噬菌体分布极广，凡有细菌存在的场所，就可