基因诊断和治疗

第一节3依据DNA生物学功能及分子遗传学中心法则，DNA（基因）在生物体蛋白质合成中起主要作用，一定结构的基因产生一定结构的蛋白质，一切生理和病理现象都直接或间接地受遗传基因控制。基因诊断的理论依据4是指运用分子生物学和分子遗传学方法对生物体的基因组DNA片段及其转录产物进行定性和定量分析，从而对疾病作出诊断。基因诊断的概念分析手段研究途径研究目的分子生物学、遗传学的技术和原理1.对DNA序列分析鉴定；2.对mRNA分析定量。在DNA水平分析、鉴定遗传性疾病所涉及基因的突变（置换、缺失或插入）5临床诊断基因诊断生化学诊断血清学诊断临床表现DNA转录mRNA翻译细胞核细胞膜蛋白质6（一）高度的特异性（二）检测灵敏度及精确性高（三）可以早期快速诊断（四）检测材料来源广（五）被检测基因不一定要处于活化状态基因诊断的特点7对患者基因或DNA本身直接进行分析，具有高度的特异性基因诊断临床诊断血清学诊断生化学诊断以疾病表型改变为依据，非特异、出现时间较晚（一）高度的特异性疾病诊断8•待测标本用量少，PCR方法可以检出pg（10-12g）水平的靶基因。•可从人类长达3×106kb的基因组中检测单拷贝基因，并可检出某一基因的单碱基改变。（二）检测灵敏度及精确性高9•如结核性脑膜炎，常规培养鉴定需几周时间，痰涂片染色镜检阳性率低，而应用PCR方法确诊只需一个工作日。•由于人体各种组织中得到的DNA都是一样的，因此，在妊娠早期取胎儿绒毛或在妊娠中期取羊水脱落细胞提取DNA，可进行遗传病的产前诊断。（三）可以早期快速诊断10•机体各种组织的有核细胞均有全套基因组DNA，都可以作为分析的材料，而不必考虑表达问题（如β珠蛋白基因、苯丙氨酸羟化酶基因）。•有的遗传病至今也不了解引起疾病的基因、基因产物和生化机理，但只要有与疾病连锁的遗传标志即可进行诊断。（四）检测材料来源广11•即使细胞中基因在静止状态时（如血斑、精液斑中的DNA），也可被测出。（五）被检测基因不一定要处于活化状态12核酸杂交聚合酶链反应基本技术基因诊断的原理基因突变：DNA缺失、插入、移码突变、点突变13已知基因的核酸序列(标记）待测的单链基因组DNA+待测DNA中含已知基因序列双链DNA（含标记物）（一）核酸杂交碱基完全配对互补结合杂交信号检测14待测物中含靶序列（二）聚合酶链反应（PCR）扩增产物检测引物、聚合酶、dNTP、MgCl2含微量靶序列的待测物(模板)+大量目的产物变性、退火、延伸循环扩增15（一）基因诊断检测的靶物•DNA（基因）分析基因的结构•mRNA从基因表达水平分析基因的功能基因诊断的条件16基因探针高度特异性灵敏显示系统基因组探针cDNA探针寡核苷酸探针RNA探针（二）基因诊断检测的探针探针:标记的已知序列核酸片段，包括DNA,cDNA,RNA,Oligonucleotide17基因组探针cDNA探针寡核苷酸探针RNA探针从相应的基因转录获得mRNA，再通过逆转录而获得。来自基因组DNA文库中有关的基因片段，经克隆或PCR扩增获得在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段。从病毒基因中分离；通过cDNA克隆或基因克隆经体外转录体系制备。基因诊断的方法MethodofGeneDiagnosis第二节19基因诊断的方法核酸分子杂交技术聚合酶链反应（PCR）技术连接酶链反应（LCR）DNA序列分析基因芯片技术限制性片段长度多态性（RFLP）分析20一、核酸分子杂交技术（一）原位（insitu）杂交（二）斑点印迹（spotblot）杂交（三）Southern印迹杂交（四）Northern印迹杂交21原位（insitu）杂交•方法：不需提取DNA或RNA，直接用培养/采集的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固定载玻片上）和细菌菌落（复印至滤膜上）与标记核酸探针杂交。•用途：可测知特定基因的存在或表达状况，还可观察被测基因在细胞内或染色体上的定位。•优点：不必提取核酸避免了抽提中核酸量的损失，因而比其他技术敏感的多，可在1%的细胞中检出目的核酸序列。22（二）斑点印迹（Spotblot）杂交•方法：将提取的样本DNA或RNA，变性后，点样吸附在硝酸纤维膜(NC)/尼龙膜上，与探针杂交；或把细胞/病毒点在膜上，变性后杂交；或培养的菌落、菌斑原位吸附于膜上，变性后杂交。•用途：基因组中特定基因及其表达的定性、定量分析。•优点：简便、快速、可在同一张膜上同时进行多样品检测。•缺点：不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。23基因诊断技术斑点杂交点样Probe-32P检测AB123424•方法：把DNA经限制性酶切割、凝胶电泳后，再转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，与标记核酸探针杂交。（三）Southern印迹杂交•用途：用于基因组中特定的基因或序列的定性及定量分析，也常用于鉴定克隆DNA的特殊序列。•优点：既可准确保持DNA序列在电泳图谱中的位置，又可检测出哺乳动物总基因组中特异的DNA顺序片段（单拷贝基因），并测定其分子量。2526（四）Northern印迹杂交•方法：将RNA经变性(非碱变性)及电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或其他固相支持物上，与标记核酸探针进行杂交反应。•用途：是分析基因表达水平的主要技术。可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性、定量分析，测知某一特定基因的表达情况。27二、聚合酶链反应（PCR）技术（一）DNAPCR（二）RT-PCR（逆转录PCR）（三）原位PCR（四）多重PCR（五）定量PCR（六）PCR-SSCP（单链构象多态性）28•方法：以所需扩增的基因组DNA为模板，进行PCR反应。经扩增的DNA片段，通过电泳分离和染色（溴乙锭或荧光染色）后，可直接在所显示的带谱上进行诊断。（一）DNAPCR•特点：通过PCR20～30次的循环，可使原来需10μg的基因组DNA才能进行的单拷贝基因的探测，减少到ng水平。29•优点：应用PCR方法，既不需Southern转移，又不必制作探针进行杂交及放射自显影等操作。且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时，故既简便又经济。•用途：用于检测单拷贝基因或DNA片段的存在，并常与核酸分子杂交结合，分析鉴定基因突变。（一）DNAPCR30（二）逆转录PCR（RT-PCR）•方法：用提取的mRNA或总RNA（含mRNA）为模板，逆转录成cDNA后，再扩增cDNA。•用途：是检测特定基因表达水平的主要方法，也是用于鉴别诊断RNA病毒的重要技术。31Reversetranscription-PCR(RT-PCR)原理32（三）原位PCR（insituPCR）•方法：不需提取DNA/RNA，直接用组织切片和细胞进行PCR或RT-PCR反应。•特点：比原位杂交的灵敏度提高50～100倍，但扩增效率不如液相PCR。•用途：在组织、细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。既能鉴定含靶序列的细胞，又能确定被测靶序列在细胞内或染色体上的位置。多用于检测病原体，尤其是对于潜伏性感染的病原体，可大大提高检出率。33①固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。②蛋白酶K消化处理：用60μg/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K。③PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增。有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。④杂交：扩增后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。⑤观察：显微镜观察结果。（三）原位PCR（insituPCR）34（四）多重PCR•方法：在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩增DNA链上的不同序列段。扩增产物经琼脂糖电泳和溴乙锭或荧光染色，即可直接在所显示的带谱上进行诊断。•用途：主要用于一些“超大”基因中大片段缺失的分析。•举例：杜氏肌营养不良症（DMD）是由于DMD基因的9个外显子区段缺失所致，可设计相应的9对扩增引物来诊断。35基因诊断技术☆多重PCR在一个PCR体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失E1E2E336（五）荧光定量PCR•一种实时监控核酸扩增的技术,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。•用途：特定DNA/RNA序列的定量分析。37•原理：不同的单链DNA（即使只差1个碱基）有不同的空间构象，即单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism，SSCP），这种不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率不同，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。（六）PCR-SSCP（单链构象多态性）38•方法：在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物用甲酰胺等变性成单链DNA，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后根据电泳带位置的差异进行诊断。（六）PCR-SSCP（单链构象多态性）•用途：是检测基因未知突变的常用技术，而且适宜于大量样本的筛选，能简便、快速、灵敏地检测有无点突变或多态性（但如欲阐明突变的碱基性质，则需作序列分析）。3940•ASO（allel-specificoligonueleotide）：等位基因特异的寡核苷酸探针。•当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成ASO探针，用同位素或非同位素标记来进行诊断。•探针通常为长20bp左右的核苷酸。（七）PCR-ASO41•用于探测点突变时一般需要合成两种探针：•探针1：与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；•探针2：与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交。（七）PCR-ASO42•PCR-ASO：即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO作点杂交。•优点：既简化了方法，又节约了时间，且只要极少量的基因组DNA就可进行。（七）PCR-ASO432Kb突变探针杂交结果子代亲代正常探针杂交结果患儿用ASO检测苯丙酮尿症（PKU）家系突变纯合体杂合体正常纯合体44•原理：在LCR体系中，需设计两对寡核苷酸探针，使第一个探针的3’-端与第二个探针的5’-端相邻，并使两个探针分别与待测DNA完全互补。耐热DNA连接酶就可以在第一次热变性、退火后，将两个寡核苷酸探针连接起来。•连接酶链反应（ligasechainreaction，LCR）又称连接扩增反应（ligationamplification）。三、连接酶链反应（LCR）45•如待测DNA在两寡核苷酸接头处有一碱基突变（置换、缺失或插入），则两寡核苷酸接头处与待测DNA就会出现一个碱基错配，在变性和退火后不再发生连接反应，最终也不会有突变位点周围序列的扩增；相反，野生型基因在LCR后会发生相应序列的扩增。通过聚丙烯酰胺电泳就可显示其差别。三、连接酶链反应（LCR）•因此，通过LCR反应，可明确区分寡核苷酸是否与模板DNA完全互补，检测基因点突变。46LCR产物5’靶DNA5’3’3’加热变性3’5’3’5’退火引物①引物②5’3’3’5’连接引物③引物④再变性、退火和连接多次循环5’3’3’5’47•优点：LCR连接反应温度接近寡核苷酸熔解温度（Tm），识别单核苷酸错配底物的互补特异性极高，其识别点突变的特异性高于PCR。三、连接酶链反应（LCR）•应用：①人类单碱基突变遗传病的产前诊断；②人群中单基因病多态性的快速筛检；③法医学中个体DNA的准确鉴定；④微生物亚种和亚型的鉴定。48四、DNA序列分析•方法：多采用DNA自动测序仪测序。可先将样品DNA进行PCR扩增，再将产物纯化后进行测序。•用途：直接分析待测基因核苷酸序列。•举例：美国ABI310型基因分析仪，具有DNA测序、PCR片段大小分析和定量分析功能。49•方法：将疾病特征性的基因片段作为靶基因固定于芯片上，从病人的血