酶联免疫吸附实验-乙肝两对半测定

酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)－乙肝两对半测定张君龙严琳临床免疫实验室2016年4月5日主要内容ELISA技术的实验原理ELISA技术的基本类型ELISA技术的操作流程乙肝病毒血清标志物乙肝两对半检测的临床意义酶免疫技术抗原抗体反应特异性酶高效催化反应的专一性酶免疫测定均相酶免疫组化酶免疫技术异相固相液相（定位，定性）（定性，定量）（ELISA）ELISA实验原理将抗体(或抗原)结合到固相载体表面，当加入标本后，相应待测抗原(或抗体)结合到固相抗体(或抗原)上，利用酶标记抗体（或抗原)和相应底物，通过洗涤、显色，测定有色产物的含量，即可检测出标本中待测抗原(或抗体)。ELISA技术基本类型间接法（检测抗体）夹心法（检测大分子抗原；抗体）竞争法（检测小分子半抗原；HBcAb,HBeAb）捕获法（检测某抗体亚型成分，IgM测定）产物颜色深浅和含量成正比产物颜色深浅和含量成反比乙肝病毒血清标志物检测原理血清学标志原理包被试剂标记或结合物结果判断HBsAg夹心法HBsAbHBsAb显色(+)HBsAb夹心法HBsAgHBsAg显色(+)HBeAg夹心法HBeAbHBeAb显色(+)HBeAb竞争法HBeAbHBeAb及中和抗原不显色(+)HBcAb竞争法HBcAgHBcAb不显色(+)HBcAb-IgM捕获法抗人IgMμ链HBcAg及HBcAb显色(+)ELISA操作流程图准备工作（试剂平衡，洗液配制，编号）加样加酶洗涤显色终止反应观察结果两步法需要温育洗涤温育操作步骤平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温(18-25℃)。配洗液：充分摇匀浓缩洗涤液，用蒸馏水按1:19稀释。（已配制）编号：将微孔条固定于支架，按序编号。操作步骤加样：分别用加样枪在孔中加入待测血清样本50ul，阴、阳性对照50ul（1滴），空白不加。加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul（1滴），空白不加，轻拍混匀。温育：贴好密封膜，置37℃温育30分钟。操作步骤洗涤：用洗涤液充分洗涤6次，洗涤完后扣干(每次洗涤保持30-60秒的浸泡时间)。显色：每孔加底物和显色剂各50ul（1滴），轻拍混匀，置37℃反应10分钟。终止：每孔加终止液50ul（1滴），混匀。观察结果：酶标仪或者肉眼判读。HBsAb检测——双抗原夹心法HBeAb检测——竞争法样本血清50μl；阴性、阳性对照各50μl（1滴）；空白不加酶结合物50μl（1滴）；空白不加37℃温育30min洗板6次，扣干底物液50μl（1滴）+显色剂50μl（1滴）37℃反应10min每孔加入终止液50μl（1滴）酶标仪读数或者肉眼判断+抗原——待测抗原抗体——固相抗体+酶标记抗体介质——液体环境+固相载体（异相）现象——显色产物作用——定性，定量ELISA——双抗体夹心法antigenantibodysubstrateEnzyme-labeledantibodyELISA三个必要试剂固相的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体酶反应底物酶高效催化反应的专一性抗原抗体反应特异性试剂盒组成包被板HBsAb－蓝色（包被HBsAg）HBeAb－紫红色(包被HBeAb和HBeAg)酶标记物（HRP标记）试剂盒组成底物液（过氧化物）和显色剂（TMB）终止液（H2SO4）洗涤浓缩液（PBS）阴性对照和阳性对照结果判断肉眼判定：通过显色与否判定阴阳性酶标仪判定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并根据cut-off值判定结果夹心法：OD值cut-off值为阳性竞争法：OD值cut-off值为阳性Cut-off值=阴性OD值×2.1Cut-off值=（阴性OD值+阳性OD值)/2注意事项严重溶血、脂血、浑浊、细菌污染可影响结果。所有样本都应按传染源处理。任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗体存在。不同厂家、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。试剂使用前需复温，浓缩洗涤液配制前应充分摇匀。注意事项加样本时要加到孔底，避免产生气泡。加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体混匀，滴加试剂时应弃去第一滴。温育时，标本要贴好密封膜，防止水蒸气和污物浸入。洗涤要彻底，各孔须加满洗液，防止孔口有游离酶残留；每次洗后应拍干；不可加水过猛，避免产生气泡及孔与孔之间的交叉污染。ELISA影响因素钩状效应——主要影响ELISA一步法的检测，由于被检测血清中（抗原或抗体）浓度过高，可出现类似于后带现象的假阴性结果。高浓度的RF——会影响双抗体夹心法和捕获法的检测，出现假阳性结果。钩状效应(Hookeffect)抗原或抗体量抗原抗体复合物量一步法二步法假阴性加入待测抗原—温育—洗涤—加入酶标抗体—温育同时加入待测抗原和酶标抗体—温育抗原或抗体量抗原抗体复合物量高浓度RF致双抗体夹心法结果假阳性RF是一种抗变性IgG的自身抗体，主要为IgM类抗体，能与多种动物的变性IgG的Fc部分结合。双抗体夹心法和捕获法时，RF可作为固相抗体和酶标抗体(均为IgG)之间的桥接抗原，产生假阳性反应。乙肝病毒血清标志物HBsAg第一个出现，感染后1-2周即可阳性阳性表示存在HBV感染HBsAb出现在HBsAg消失后保护性抗体疫苗免疫成功的标志乙肝病毒血清标志物HBeAg病毒复制标志传染性强HBeAb传染性降低长期存在是DNA与肝细胞整合的结果乙肝病毒血清标志物HBcAgHBV复制的标志血清中检测不出来IgM-HBcAb急性HBV感染IgG-HBcAb急性感染恢复期和慢性持续感染常见模式及临床意义1HBsAg2HBsAb3HBeAg4HBeAb5HBcAb临床意义+－+－+急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV复制，传染性强－大三阳+－－++急性HBV感染趋向恢复；慢性HBsAg携带者；传染性弱－小三阳+－－－+急性HBV感染；慢性HBsAg携带者；传染性弱+－－+－慢性HBsAg携带者易转阴；急性HBV感染趋向恢复+－+－－急性HBV感染早期或慢性携带者，传染性强+－－－－急性HBV感染早期；急性HBV感染潜伏期；慢性HBV携带者，传染性弱常见模式及临床意义1HBsAg2HBsAb3HBeAg4HBeAb5HBcAb临床意义－++－+非典型性或亚临床型HBV感染;早期恢复－+－－－注射过乙肝疫苗有免疫力；既往感染；假阳性－+－++急性HBV感染后康复－+－+－HBV感染后已恢复－+－－+既往感染，仍有免疫力；HBV感染恢复期－－－－+既往感染未能测出HBsAb；恢复期HBsAg已消，HBsAb尚未出现；无症状HBsAg携带者－－－－－过去和现在未感染过HBV急性乙肝血清学变化乙肝两对半的检测方法酶联免疫吸附法（ELISA）：简便、价廉、定性（能否进行定量检测？）化学发光免疫分析法（CLIA）电化学发光免疫分析法（ECLIA）灵敏度、准确性、重复性、速度、自动化程度均较高夹心法（双位点一步法）——要求抗原或抗体有多个抗原决定簇位点固相抗体（或抗原）待测抗原（或抗体）酶标抗体（或抗原）EEEEEAB间接法固相抗原固相抗体待测抗体中和抗原酶标抗体显色竞争法HBeAb抗体检测VSE竞争法（改良）固相抗原抗体复合物待测抗体酶标抗体HBeAb抗体检测显色VS捕获法特异性IgM非特异性IgM阴性质控123456789101112ABCDEFGH样本孔阳性质控HBsAb空白HBeAbS1——S9e1——e9ELISA加样模式图每个实验台（6个人）一组，每组加一条HBsAb和一条HBeAb