07-1第七章1节微生物的生长

1第七章微生物的生长和遗传变异第一节微生物的生长及其特性第二节微生物的遗传第三节微生物的变异第四节遗传工程第五节微生物的驯化与保藏2第一节微生物的生长及其特性一、生长与繁殖的基本概念二、微生物生长的测定方法三、微生物的生长特性四、微生物膜的生长特性3一、生长与繁殖的基本概念何谓生长？同化作用大于异化作用时，细胞质的量增加，表现在细胞体积或重量的不断增加，这种现象称生长。何谓繁殖？生长一定程度后细胞分裂，这就是细菌的繁殖。个体的生长和繁殖体现为群体的生长。（微生物重量或数目的增加）。群体生长＝个体生长＋个体繁殖在微生物学中“只有群体的重复”才更有意义，因此“生长”一般指群体生长。第一节微生物的生长及其特性4二、微生物生长的测定方法第一节微生物的生长及其特性生理指标法计数法生物量法定量测定方法直接计数法（显微镜、流式细胞仪）间接计数法（关注：活细胞染色法、特定细胞计数法）体积法重量法（湿重法、干重法MLVSS）组分法元素法呼吸强度耗氧量酶活性生物热51.计数法（1）直接计数法（显微镜）①涂片染色法：一定量样品涂布在载玻片上，染色后计数。②滤膜染色法：一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。计数之前都需把样品预处理分散第一节微生物的生长及其特性6Measurementoftotalcellcounts全细胞染色法（死活不分）：DAPI染色，DTAF染色第一节微生物的生长及其特性DAPI:4'6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride2Cl-H2N+NH2CNHH2N-CNH2DAPI染色7DNA5-DTAF:5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluoresceinOOHOOHOOHNHNNClNClDTAF染色法第一节微生物的生长及其特性8③计数器法:如血球计数板法④比例计数法：将已知颗粒浓度的液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下，测各自的数目。（内参概念）第一节微生物的生长及其特性9亚甲基蓝染色法（MethyleneBlue）（酵母活细胞计数）活细胞：无色死细胞：蓝色吖啶橙染色法（AridineOrange）（在紫外显微镜下观察细胞的荧光）活细胞：弥散绿色荧光死细胞：绿色亮点（凋亡小体）•活细胞染色法第一节微生物的生长及其特性10TetrazoliumsaltreductionmethodFormazanNHRNNR’NRC[H]甲撍化合物TetrazoliumchlorideNRRNNNCl-+R’四氮唑化合物（染料）四氮唑化合物（染料）染色法第一节微生物的生长及其特性11TTC：2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazoliumchloride）CNNNN+Cl-无色；被还原后生成红色的2,3,5-三苯基甲撍（TF）：TriphenylformazanCNNHNN2H+HCl第一节微生物的生长及其特性常用的四氮唑化合物（染料）12CTC:5-cyano-2,3-ditolyltetrazoliumchlorideCTCCl-NNNNCNCN3+CN3[H]第一节微生物的生长及其特性CTCFNHNNNCCNCN3CN3CTCF:CTC-formazane13双重染色法DTAF和CTC双重染色法10µm第一节微生物的生长及其特性14•低活性细胞的计数（细胞增大技术）DVC(DirectViableCount)methodNNH3CNalidixicacid（萘啶酮酸）(1-ethyl-1,4,dihydro-7-methyl-4-oxo-1,8-aphthyridine-3-carboxylicacid)DNA复制抑制剂30ºC,18hourincubatedNalidixicacidYeastextract第一节微生物的生长及其特性15（2）间接计数法（活菌计数法）①平板计数法：测定菌落数，（注意：可培养的微生物很少）描述：CFU（colonyformationunit）②液体计数法（MPN法，mostprobablenumber法）：最可能数法主要用于在平板培养基上不易形成菌落的菌（硝化菌、反硝化菌、硫酸还原菌）③液膜法：过滤到滤膜上（把膜放在固体培养基上培养）第一节微生物的生长及其特性1617（3）特定微生物计数法平板法液体法e.g.Cr6+耐性微生物抗生素抗性菌亚硝酸菌、硝酸菌的计数②FISH（荧光杂交法）FluoreseuceInsituhybridization16sRNA的碱基组成—设计特异的探针（probe）①选择性培养基法第一节微生物的生长及其特性18Principleoffluorescentinsituhybridization(FISH)rRNAOligonucleotideprobeFluorescence第一节微生物的生长及其特性19FISH法的步骤萤光标示探针(Probe)渗透rRNA固定細胞Hybridization萤光显微镜观察、计数第一节微生物的生长及其特性2010µmFISH法DTAF染色土壤中微生物的测定(例子)探针特异性微生物同视野第一节微生物的生长及其特性212.生物量法（1）测体积：离心或自然沉降后观察体积(粗放的方法)（2）测细胞干重：离心法、过滤法两种105~110ºC下干燥后称重（干重约为湿重的10~20%）活性污泥浓度测定方法：MLSS（mixedliquidsuspendedsolid）混合悬浮固体MLVSS（mixedliquidvolatilesuspendedsolid）550ºC、2h、马福炉（3）比浊法/光密度法OD（opticaldensity）Λ＝450~660nm,可见光第一节微生物的生长及其特性22（5）细胞含氮量细菌含氮量12.5%、酵母为7.5%粗蛋白量＝6.25×N量（6）DNA、蛋白质同一微生物的DNA和蛋白质含量相对稳定，所以可以通过测量DNA、蛋白质的量评价生物量。（7）ATP、RNA可以反映活性微生物的量（8）微生物呼吸醌类1g含活性污泥平均约含1μmol呼吸醌类。（4）测细胞含碳量POC（particulateorganiccarbon）POC＝12Xmg/l特点：快、低浓度也可测TOC（totalorganiccarbon）：总有机碳DOC（dissolvedorganiccarbon）：溶解性有机碳第一节微生物的生长及其特性23三、微生物的生长特性1、间歇培养（Batchcultivation）和生长曲线（growthcurve）接种第一节微生物的生长及其特性间歇培养：将少量微生物接种于一定量的液体培养基内，在一定条件下培养。培养过程不投加或取出任何东西。这种培养方式叫间歇培养。生长曲线：细胞量随时间的变化曲线称生长曲线。24总细胞数微生物的典型生长曲线活细胞数ⅠⅡIIIⅣ培养时间细胞个数第一节微生物的生长及其特性2500时间微生物数生长速度缓慢期对数期稳定期衰亡期活菌数总菌数微生物生长曲线（按微生物数目的对数绘制）26时间活微生物重量生长率上升阶段生长率下降阶段内源呼吸阶段微生物生长曲线（按微生物重量绘制）第一节微生物的生长及其特性271)缓慢期(亦称延滞期,lagphase）影响缓慢期长短的因素：•接种龄：种子（inoculum）处于什么生长期。Ⅰ、ⅣⅢⅡ•接种量：特别是X0/S0，即初期微生物浓度与基质浓度的比。•培养基成分产生缓慢期的原因：缺乏分解有关基质的酶；缺乏充足的代谢中间产物总细胞数活细胞数ⅠⅡIIIⅣ培养时间细胞个数特点：生长速率常数近于零细胞形态变大rRNA含量增高合成代谢较活跃第一节微生物的生长及其特性282）对数期（stationaryphase）亦称指数期（exponentialphase）最短总细胞数活细胞数ⅠⅡIIIⅣ培养时间细胞个数细胞数（量）以指数形式增加的时间段。特点：•生长速率最大，世代时间（generationtime）倍加时间（doublingtime）•酶系活跃、代谢旺盛•细胞进行平衡生长，体内各成分最为均匀第一节微生物的生长及其特性29指数期的数学描述1dxrkXdt10lnXKtX10KtXXe世代时间0ttGnn世代数02nXX0lglglg2XXn第一节微生物的生长及其特性303）稳定期（stationaryphase）：亦称恒定期、最高生长期、生长速率下降期等特点：净增长速度接近零繁殖与死亡速度几乎相等正生长与负生长几乎相等生长速率下降阶段S很低，其浓度对微生物影响大2dskSdt即有机物分解速率与其浓度成正比出现稳定期的原因：营养物尤其是生长因子耗尽营养物比例失调代谢物的积累pH、DO、氧化还原电位的变化第一节微生物的生长及其特性314）衰亡期（declinephase,deathphase）内源呼吸期（endogenousrespirationphase）内源呼吸：体内贮藏物质酶等一部分细胞物质的氧化。特点：•细胞形态多型化•细胞会发生自溶现象（autolysis），蛋白质水解酶活力•往往产生芽孢出现衰亡期的原因：•营养物不足（代谢产物的积累）•外界条件恶化总细胞数活细胞数ⅠⅡIIIⅣ培养时间细胞个数第一节微生物的生长及其特性322、间歇培养时微生物生长的数学描述（1）生长与基质浓度的关系微生物比增长速度：1dxdtx单位时间，单位微生物量的增加量max基质浓度s第一节微生物的生长及其特性33maxssksKs:饱和常数，与max12的s值相等KsS时maxmaxssSkSkkSmaxsKsMonod公式（莫诺特公式）经验公式（微生物增长）第一节微生物的生长及其特性34()dxdsadtdtdskxdt1dxkxdt1)对数期：bx项忽略不计(2)细胞浓度变化：()dxdsabxdtdta:合成系数/菌体收率污染物转化系数b:内源呼吸常数总细胞数活细胞数ⅠⅡIIIⅣ培养时间细胞个数第一节微生物的生长及其特性因为S浓度很高Sks352）稳定期（生长下降期）：ssk2dsksdtX变化不大;x≈constdxbxdt3）衰亡期（内源呼吸期）：()dsadt项可忽略总细胞数活细胞数ⅠⅡIIIⅣ培养时间细胞个数第一节微生物的生长及其特性36微生物生长期与废水生物处理：（活性污泥等的混合微生物群，也有类似的生长曲线。)水处理中如何避免缓慢期？接种对数期或代谢旺盛的污泥增加接种量污泥驯化（以后详细讲）微生物维持在对数期可获得高的处理能力，即分解速率，但处理效果不一定好，为什么？菌活力大，不易凝聚和沉淀需要充足的营养物，故得不到好的水质第一节微生物的生长及其特性37处于稳定期污泥虽然生长速度有所下降，但有一定的代谢活性，絮凝沉降性能好。故传统的活性污泥法常运行在这个范围。衰亡期只出现在某些特殊的水处理场合，如延时曝气及污泥消化。第一节微生物的生长及其特性38食料/微生物比代谢速率内源呼吸阶段生长率下降阶段生长率上升阶段（沉降性能好）（沉降性能差）大多数活性污泥处理系统运行范围延时曝气，污泥消化注意：各个阶段的食物/菌量比(F/M)发生变化，相当于活性污泥系统的污泥负荷。第一节微生物的生长及其特性微生物代谢速率与食料/微生物比的关系393、连续培养（continuouscultivation）是一种连续进料又连续出料的培养方式根据控制因素的不同分为恒浊连续培养（turbidostat）恒化连续培养（chemostat）进料速度保持一定4.半连续培养（semi-batchcultivation）、半间歇式Fillanddraw第一节微生物的生长及其特性405.分批补料式培养（fedbatch）以低速把高浓度的营养物质连续加入培养器中，但不排出物料。体积是随时间变化的特点：能任意控制培养液中的底物浓度，所以没有流出。供应速度与微生物消费速度达到平衡，所以能保持一定的浓度。主要用于：•有抑制作用的底物•生长因子添加•高浓度菌体培养添加方法定速添加指数添加dvdt=c