生理实验五-蛙坐骨神经腓肠肌标本的制作及刺激与反应的关系.

实验五蛙坐骨神经—腓肠肌标本的制备及刺激与反应的关系实验目的：•掌握蛙类坐骨神经腓肠肌标本的制备方法。•应用电刺激方法测出肌肉阈刺激、阈上刺激与最适刺激的强度值•了解刺激与肌肉收缩的关系实验原理•两栖类动物的一些基本生命活动和生理功能与恒温动物相似，其离体组织器官所需的生活条件比较简单，并且易于控制和掌握，因此在生理试验中常用蟾蜍或蛙类的离体组织器官作为试验标本。蛙类坐骨神经－腓肠肌标本是研究神经冲动和肌肉收缩机能等生理试验最常用的试验材料，制备此标本是生理试验的一项基本但又非常重要的操作技术。•兴奋性：可兴奋组织对外界刺激发生反应的能力（或细胞受刺激时产生动作电位的能力）。•兴奋：也就是动作电位，指可兴奋细胞受阈刺激或阈上刺激时，细胞在静息电位的基础上发生一次迅速的、短暂的并可扩布的电位变化。•阈强度：在刺激持续时间和刺激强度-时间变化率固定时，引起可兴奋细胞产生动作电位的最小刺激强度，也叫阈值或阈刺激。•阈刺激或阈上刺激产生动作电位，其特点：①“全或无”现象；②进行长距离无衰减传递（神经纤维、骨骼肌细胞等）。•阈下刺激引起局部电兴奋，其特点：①幅度在阈下刺激的范围内，随刺激强度的增大而升高；②在细胞膜上可进行电紧张性扩布，即衰减性传播；③可以相互融合（时间总和、空间总和）。•最适刺激强度：引起肌肉产生最大收缩时的最小刺激强度。•刺激包括三方面的内容：刺激强度、刺激时间、刺激强度-时间变化率。其中，刺激强度就是电刺激的脉冲电压，刺激时间就是某个单刺激所持续的时间。•刺激强度对骨骼肌收缩形式的影响（固定刺激的时间和刺激强度-时间变化率）：1.单根神经纤维或肌纤维对刺激的反应是“全或无”式的。2.但在神经纤维肌肉标本中，则表现为当刺激强度很小时（阈下刺激），不能引起神经纤维动作电位的产生和肌肉的收缩；3.当刺激强度在一定范围内变动时，肌肉收缩的幅度与之成正比。因为坐骨神经干中含有数千万条粗细不等的神经纤维，其兴奋性各不相同。弱刺激只能使其中少量兴奋性高的神经纤维先兴奋，并引起它所支配的少量肌纤维收缩。4.随着刺激强度逐渐增大，发生兴奋的神经纤维数目逐渐增多，其所引起收缩的肌纤维数目亦增多，结果肌肉收缩幅度随刺激强度的增加而增强。当刺激达到某一强度时，神经干中全部神经纤维兴奋，它们所支配的全部肌纤维也都发生兴奋和收缩，从而引起肌肉的最大收缩。此后，若再增加刺激强度，肌肉收缩幅度将不再增加。我们把引起肌肉产生最大收缩时的最小刺激强度叫最适刺激强度。•刺激频率对骨骼肌收缩形式的影响（把刺激强度固定在最适刺激强度，把单刺激改为连续单刺激）：•刺激频率就是单位时间内连续刺激的次数。随着刺激频率的增高，肌肉的反应依次表现为单收缩、不完全强直收缩和完全强直收缩：•⑴如果刺激频率很小时，每相邻两个刺激的间隔时间很大，当其大于肌肉收缩的收缩期和舒张期之和时，肌肉表现为一个个的单收缩。单收缩包括收缩期及舒张期。前者占时较后者为短。•⑵当逐渐增加刺激频率，使新的刺激引起的肌肉收缩落在前一个刺激引起肌肉收缩的舒张期，这样，肌肉在连续未完全舒张的基础上就开始新的收缩，形成锯齿样的不完全强直收缩张力曲线。•⑶当刺激频率继续增大时，新的刺激引起肌肉收缩落在前一次刺激引起肌肉收缩的收缩期，这样，肌肉在连续收缩不全的基础上出现新的收缩，形成一个类似方波的完全强直收缩张力曲线。实验用品•实验动物：蟾蜍•试剂与器材：计算机、BL-420F生物信号处理系•统、手术剪、手术镊、玻璃分针、•蛙板、锌铜弓、张力换能器、•连接导线、刺激输出、烧杯、任氏液、•棉球、棉线等。实验步骤：•㈠坐骨神经-腓肠肌标本的制备•1、破坏脑和脊髓•2、去除躯干上部、皮肤及内脏•左手捏住蟾蜍的脊柱，右手持粗剪刀在前肢腋窝处连同皮肤、腹肌、脊柱一并剪断，然后左手握住蟾蜍后肢，仅靠脊柱两侧将腹壁及内脏剪去（注意避开坐骨神经）。并剪去肛门周围的皮肤，留下脊柱和后肢。•3、剥离皮肤•一只手捏住脊柱的断端（注意不要捏住脊柱两侧的神经），另一只手捏住皮肤的边缘，向下剥掉全部后肢的皮肤，将标本放在盛有任氏液的玻璃器皿中。将手及使用过的全部器械冲洗干净。•4、分离双下肢•将标本提起，剪去向上突起的骶骨，然后沿正中线将脊柱剪为两半，并从耻骨联合处剪开两侧下肢，浸入盛有任氏液的培养皿中使用。•5、辨认蛙后肢主要肌肉，找出腓肠肌。•6、游离坐骨神经和腓肠肌•取一侧下肢固定于蛙板上，固定时，坐骨神经、腓肠肌向上，先用玻璃分针沿脊柱游离坐骨神经腹腔段，分离坐骨神经直至腘窝（不要伤及神经）；再用玻璃分针分离腓肠肌，并在肌腱上穿线结扎。•7、剪去其他不用的组织•在坐骨神经两端各留一块骨头和肌肉，以便于固定。•注意：剥离时一定要保持标本完整性；尽可能用玻璃分针，少用镊子，避免刺激神经。•8、标本检验•完整的标本应包括四部分：一段脊柱骨、坐骨神经、腓肠肌、一段股骨头。用镊子轻轻提起结扎神经线，经任氏液沾湿的锌铜弓短暂轻触坐骨神经，如腓肠肌发生迅速的收缩反应，则表明机能完好。将标本置于任氏液中，稳定其兴奋性15－20min，即可进行实验。•9、将坐骨神经-腓肠肌标本固定于蛙板上，把跟腱端的接线与张力换能器相连，调节高度与张弛度。实验项目1.刺激强度与反应关系①刺激腓肠肌：调节刺激参数，选择单刺激，改变刺激强度（从弱到强），观察刺激强度变化对肌肉收缩的影响；找出阈强度、最适刺激强度；②刺激神经：调节刺激参数，选择单刺激，改变刺激强度（从弱到强），观察刺激强度变化对肌肉收缩的影响；找出阈强度、最适刺激强度；③比较腓肠肌与神经的兴奋性2.刺激频率与反应的关系：•调节刺激参数，固定最适刺激强度，改变刺激频率（从低到高），用连续单刺激刺激腓肠肌，观察刺激频率变化对肌肉收缩的影响。①单收缩曲线②复合收缩③强直收缩注意事项•在制备标本时，避免过度牵拉、手或金属器械触碰神经干；不能使动物皮肤分泌物，血液等污染神经和肌肉，不可用水冲洗，•制备标本及实验中，随时用任氏液润湿神经和肌肉，防止干燥。•刺激参数确认后，再进行刺激，防止神经肌肉损伤。•每改变一次刺激频率后，应休息0.5-1min,每次刺激•不要超过3-4秒，以免标本疲劳。•选择刺激时，选程控刺激•刺激时注意观察肌肉的反应实验结果1.记录肌肉与神经的阈强度、最适刺激强度，并比较二者的兴奋性；2.记录在最适刺激强度下，刺激频率与肌肉收缩的关系思考题1.制备好的神经肌肉标本为何要放在任氏液中？2.为什么刺激频率增高肌肉收缩的幅度也增大？•随着刺激频率的增高，各次刺激引起的收缩过程发生融合而叠加起来，这时肌肉强直收缩产生的张力大于单收缩，这可能与连续刺激肌肉时，从肌质网重复释放的Ca2+浓度，使横桥得以有较长的时间持续活动有关。3.何谓阈下刺激、阈刺激、阈上刺激和最适刺激？在阈刺激和最适刺激之间为什么肌肉的收缩随刺激强度的增加而增加？