2014年艾滋病培训班潘晶

Page1济南市艾滋病筛查实验室检测技术培训济南市CDC潘晶2014.10Page2目录1.艾滋病筛查实验室较常使用的实验方法的注意事项2.实验室的质量控制3.艾滋病职业暴露的处理4.实验室生物安全5.月报管理6.实验室督导考核总结Page3常用的实验方法-酶联免疫法是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。标记免疫技术一般分为两类。免疫组化技术酶联免疫法Page4ELISA基本原理免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法。特点是具有高度的特异性和敏感性。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体—固相的抗原或抗体—酶标记的抗原或抗体—酶作用的底物Page5目前主要使用双抗原夹心法最常用的方法，操作步骤如下：将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原（在商品化的试剂盒中，已经完成此步骤）加标本形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去未结合的物质加酶标志物，彻底洗涤未结合的酶标志物加底物，根据颜色反应的程度进行该抗体的定性判断加终止液，在限定时间内放入酶标仪内读数Page6ELISA的成品试剂盒中包含以下各组分：(1)已包被抗原或抗体的固相载体(96孔板)(2)酶标记的抗原或抗体(酶结合物)(3)酶的底物（缓冲液和底物液或称A/B液）(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)(5)有些试剂盒中还有标本的稀释液(6)洗涤液（基本为通用的浓缩磷酸盐溶液）(7)酶反应终止液（一般为弱硫酸液）ELISA试剂盒的组成Page7ELISA方法模式图Page8ELISA检测需注意的问题：操作环境在实验室的污染区内完成各项实验。必须在生物安全柜内进行。实验人员必须穿着防护服，带口罩、帽子、手套等。Page9实验室的环境温度对ELISA实验的结果准确性有很大的影响一般室温条件为：18-25℃水浴箱/孵育箱的温度应严格控制在：37℃实验室必须放置温湿度剂水浴箱/孵育箱内放置水银温度计，不可放置湿盘ELISA检测需注意的问题：环境温度Page10仪器的校准鉴定是确保整个实验顺利进行的重要条件之一，是必须具备的。仪器鉴定要提前进行，以防止仪器使用中出现鉴定过期现象。仪器的鉴定管理最好有专人负责管理。仪器包括：微量移液器、酶标仪、洗板机、水浴箱。ELISA检测需注意的问题：仪器的校准Page11酶标仪是决定整个实验室准确性最关键的设备，因此每年都需要进行仪器鉴定。在日常工作中，最少一个月要进行一次仪器维护，观察仪器的进出板是否顺畅，比色是否正常。2次鉴定之间要作至少一次的期间核查，自行配制比色样品，进行重复检测，观察重复性。ELISA检测需注意的问题：酶标仪的维护及核查Page12洗板机也是影响试验准确性的重要仪器。洗板机每天开/机关机必须进行冲洗1-3次。冬季洗板机要加强维护，每次开机前确保注液吸头和排液吸头是通畅的，没有被磷酸盐溶液堵塞。洗板完要进行拍板，注意观察残留量的多少。孵育时板孔上一定要贴膜ELISA检测需注意的问题：洗板机的维护Page13在试验最后一步比色的时候，要设定基线值。一般设定1个空白孔，以空白孔的OD值为基线值，也就是常说的空白孔调零。样品OD值=实测值-空白值另一种方法是设定双波长，一般是设定450nm和620nm波长。样品OD值=450nm实测值-620nm实测值双波长测定理论上能抵消干扰物质的OD值，优于单波长检测。实际试验中，一般要求设空白孔，又建议双波长检测，如果同时使用会导致最终结果偏低。因此对于单次试验建议只使用一种方法。ELISA检测需注意的问题：比色波长的设定Page14临界值（cutoff值）是界定样品阴阳性的标准以珠海丽珠为例：cutoff值=NC+0.15。（阴性对照0.08，按0.08计算）注意说明书的小字部分因此在NC0.08时，cutoff值=0.230.S/CO值的计算：S/CO值=样品OD值/cutoff值S/CO值≥1为阳性，反之为阴性。艾滋病的检测没有灰区ELISA检测需注意的问题：Cutoff值计算Page15外部质控目的：为了监控检测的重复性和稳定性，试剂盒批间或孔间差异。质量控制是实验室的“灵魂”包括强阳性、弱阳性和阴性对照血清。也可以只设置一个弱阳性对照，以该试剂盒临界值（cutoff值）的23倍为宜。ELISA检测需注意的问题：外部质控的设定Page16ELISA检测需注意的问题：其他注意事项—按说明书设置阴、阳性的对照孔数量，不可随意减少—观察样本的形状，有无溶血和富脂质血—观察水浴箱内的温度计指示，和水箱水位高度—观察残留量，吸、排液孔是否堵塞（特别是冬季）—及时校准酶标仪，注意空白孔的数值必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检验合格、在有效期内的试剂。推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。Page17检测试剂的选择按照中国疾控中心性病艾滋病预防控制中心网站上公布的质量评估报告选择前几位的试剂公司Page18常用的实验方法-胶体金/硒法样本量要加足，对于粘稠的血清，也要适量加入稀释液观测时间要严格控制，15-30分钟。过长过短都容易造成失误，建议配计时器。快速实验也必须填写原始记录，有条件的单位，使用拍照/摄像仪器进行实验结果记录。Page19Page20Page21常用的实验方法-化学发光法敏感度较高——假阳性的产生增多注意复测，对样本质量要求较高，尽量使用血清进行检测工作人员操作时，注意自身安全防护仪器的鉴定，每年厂家都要出具检测证书质量控制要求与酶联免疫法相同Page22实验时需要注意的事情实验前：—调整室温至18-25℃（开空调）—平衡试剂30分钟，确认有效期（提前从冰箱取出试剂盒）—清点样本数量，进行“唯一性”编码（不可每日从1号开始）—预热仪器，检查仪器状态（莫到要用了，才发现坏了）Page23实验中：—严格按照说明书进行检测，随时阅读—准备“实验记录本”，边做边记录时间、实验结果及特殊状况等—将血清编号，完善储存，及时清理消毒生物安全柜及周边环境实验后：—进行原始记录的书写，完成仪器使用登记—发出检测报告Page24原则：“只要做实验就要写记录”内容包括：—96孔定位表:样本的位置要与OD结果相对应—试剂类型、厂家、批号及有效期—环境温/湿度—简要的操作步骤，Cutoff值的计算公式—实验小结：主要描述样本结果的阴阳性，阳性反应结果必须标清样本的唯一性编号—最重要的2人手写签名此处看图片酶标法检测原始记录的书写Page25•原始检验记录不得携出所外，不得私自泄露有关内容。•实验记录应按规定定期装订归档保存（线状或胶装），此项为现场督导必查内容。•检验或试验结果无论成败，均应详细记录，失败的应及时总结分析，并在原始记录上注明。•检验记录如发现有误，可在原处加一斜线划去，并签名或盖章，必要时注明情况，但不得涂改，原处字迹必须清晰可辨。Page26报告格式：阴性报告“HIV抗体阴性（-）”阳性反应样本填写“HIV复检检测单”和“阳性样本转运登记表”；并同时填写电子版发往[e-mail]。需及时发送，以免耽误报告的发放样本装入2ml的螺帽口冻存管，用油性记号笔标注姓名；三层包装，使用生物转运箱专人专车；在冻存状态下及时送往济南市疾控中心艾滋病确证实验室（13楼）Page27WHO提出的三级包装系统：第一层容器：冻存管——直接装样品，应防渗漏——标明样品的唯一性编码和受检者姓名——在试管的周围应有缓冲吸水材料，以免碰碎Page28第二层容器：容纳并保护冻存管，可以装若干个冻存管。要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。WHO提出的三级包装系统：Page29第三层容器:生物安全转运箱—贴有醒目的标签—便于携带，坚固并易于消毒WHO提出的三级包装系统：Page30样本的包装Page31Page32送检单应与样品分开放置Page33填写仪器使用登记：必须填写的是：生物安全柜、酶标仪、洗板机、水浴箱填写其他相关记录：环境检测记录、消毒记录、废弃物处理记录、冰箱监测记录等注：有冷链监控系统的，也应每月打印一张监控图备案查询数据库的录入，及时标注质控点、绘制质控图检测数据结果要求纸质及电子双记录，以便查询质控图需及时绘制，以观察实验稳定性每月5日之前，上报双系统的月报仪器使用及相关记录的填写Page34艾滋病筛查实验室还应做的工作承担部分艾滋病咨询工作—对于“HIV抗体不确定（±）”患者，及时通知本人，四周后再次复检。—对患者提出的艾滋病相关问题，耐心细致回答的义务—妥善保存血清样本，长时间保持血清样本，应-20℃/-70℃冻存。—对于血清检测量较大的医院，应将阴性血清保存2周-1个月。—按年度装订各项检测资料，并编写目录，方便查阅。每年接收艾滋病筛查中心实验室的盲样考核和现场督导每年派工作人员参加艾滋病相关培训Page35实验室质量控制Page36什么是质控品，有什么用？质控品是强阳性、弱阳性和阴性的质控血清。目的：监控试验检测的重复性而设置的。—可以只设置一个弱阳性质控标准是：以该试剂盒临界值（Cut-off）的2～3倍为宜。Page37购买商品化的质控品（推荐）—向生物制品公司或试剂生产厂家购买自行配制—使用HIV阳性血清+阴性血清，稀释而成（不建议）怎么获得质控品？Page3860/110μl阳性血清60/110μl阴性血清60/110μl阴性血清60/110μl阴性血清60/110μl阴性血清60/110μl阴性血清60/110μl阴性血清如果购买了高浓度的质控品，请稀释将梯度稀释后的样品同普通样品一样进行OD值测定Page39每一次实验必须使用室内质控品，以便监控实验的重复性室内质控品的管间或瓶间变异系数（cv＜20%）质控品应稳定、无菌，且不含有影响试剂反应的防腐剂。Page40分装冻存—多分装，每管留够用1个月的量就可以—注意有效期。购买的按照说明书；—自行配制的多为半年或1年。—保留好购买、配制及稀释分装等文字资料。盲样考核时需提供怎么保存质控品？Page41每次做实验时，将质控品作为普通样本进行检测在上批次的质控品快要用完时，提前购买新一批的质控品将新质控品当普通样本检测20次，获得新质控品的基础数据值，并妥善记录存档怎样使用质控品？Page42错误的理解1：酶联免疫法是质控方法吗？×—ELISA是检测方法，非质控方法错误的理解2：所有的实验室都是用即刻法+L-J法吗？×—一年检测量少于20次的使用即刻法—一年检测量大于20次的使用（即刻法）+L-J法什么是质控方法，怎么用？Page43第一次使用质控品时，可一次做3个孔，第3个数值就可以进行质控了之后每次试验，做1个孔，记录数值。直至满20次。然后排序、计算均值、标准差、变异系数计算SI上限值和SI下限值比对SI值表，判断是否受控即刻法怎么做？Page44⑴将质控血清的测定值从小到大排列：x1，x2，x3……xn(x1为最小值，xn为最大值)。⑵计算平均值和标准差。⑶计算SI上限值和SI下限值。⑷将SI上限、SI下限与“SI值表”中的数字比较。每增加一个测定值都要重新计算平均值和标准差，重复以上各项计算即刻法的计算方法Page45《全国艾滋病检测技术规范》2009版中有原图Page46以上数据均使用电脑计算Page47在“即刻法”的基础上做即刻法产生的20个数据转为基础数据根据基础数据计算“L-J”中的均值、标准差从第21个数据开始L-J法的质控L-J法怎么做？Page48质控原则及标准在控：质控数值的大小在均值±2倍标准差的范围内告警：当质控数值超出均值±2倍标准差的范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察失控：当质控数值超出均值±3倍标准差的范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受Page49位移：连续几次（35次）质控值落在均值的一侧则称为位移，提示实验条件发生了较大的变化。—更换了新的试剂盒\孵育时间