细胞培养放大指南

9培养更多细胞：细胞培养放大简易指南JohnA.Ryan，Ph.D.康宁公司生命科学900ChelmsfordSt.Lowell，MA01851目录简介..................................................................................9系统选择.........................................................................10选定最佳系统..................................................................15关键技巧.........................................................................18培养液问题.................................................................18液体处理问题..............................................................20悬浮培养问题..............................................................20贴壁细胞培养问题......................................................22参考文献.........................................................................23简介人类需要更多细胞…在进行以细胞为基础的试验和化验时，生命科学研究人员常常需要制造大量细胞以产生重组蛋白、抗体和病毒载体。当需要更大量的细胞时，研究人员必须从纷繁复杂的各种细胞培养器皿、系统和方法中进行甄选。康宁公司提供的本指南旨在帮助研究人员选择最符合其需求的器皿和方法以培养出更多细胞或生产出更多细胞产品。本指南主要介绍适合生产至少1x109个细胞（约1克）的基础系统。本指南并非针对需要生产更大量细胞的研究人员、或临床或工业级的生产而设计，但本指南提供的许多信息亦适用于这些场合。本指南的目标之一是尽可能的简化放大过程，以提高成功率。另一个目标是尽量降低该放大过程的成本，为预算紧张的研究实验室节省资金。因此，本指南不包括中空纤维灌注系统、固定和流化床反应器、气动式和搅拌式生物反应器，以及其它在设备和自动化方面需要大量资金投入的系统。对于这些更加昂贵或复杂的放大系统和方法，参考文献部分为您提供了更多有用信息。10图1：80多年来，生命科学研究人员一直在使用康宁产品进行细胞培养。系统选择选择放大系统的第一步是查看康宁为研究实验室推荐了哪些系统（图2）。并根据您自身的特定需求和情况来评估各个系统。康宁提供了6个系统用于放大贴壁细胞：◗具有较大表面积的培养瓶◗245mm方形培养皿◗滚瓶◗CellSTACK®多层细胞培养器◗HYPERFlask™多层细胞培养瓶◗E-Cube™生物反应器针对细胞悬浮培养的放大，康宁提供如下产品：◗一次性塑料旋转瓶和可重复使用型玻璃旋转瓶◗一次性锥形塑料摇瓶和可重复使用型锥形玻璃摇瓶培养瓶第一个细胞培养瓶于1923年由AlexisCarrel发明。培养瓶使用PYREX®玻璃制成，瓶身为圆形，平底，直颈或斜颈。它们被称作“D”瓶，“D”指它们的直径：D-3.5培养瓶表示瓶的直径为3.5厘米。1947年，WilliamEarle推出了呈六边形或矩形的“T”瓶。“T”指的是用于瓶内可用于细胞生长的总表面积：比如，T-25瓶的细胞生长面积即为25平方厘米。到20世纪60年代，直颈T瓶开始采用经处理的聚苯乙烯制模，从而增强了细胞的附着力。1974年，康宁开发出第一个聚苯乙烯斜颈T瓶，使研究人员能够更加方便地使用移液管来处理单层细胞。康宁提供5个型号的斜颈T瓶，其培养面积从25平方厘米到225平方厘米（表1）。这些培养瓶大多可用于标准细胞培养表面或能够提高细胞附着力的康宁CellBIND®表面。康宁培养瓶的瓶盖有多种类型可供选择。为减少二氧化碳培养箱中的污染问题，我们强烈推荐使用透气盖。优点传统技术，方便使用方便使用移液管，便于细胞的加液和采集。可利用显微镜迅速判定细胞生长情况减少培养液外溢及培养过程的污染无需其它设备缺点培养量大时工作强度较高：培养1x109个细胞时需要44个T-225培养瓶（图3）占用培养箱空间较多冷冻保存管单个培养瓶多个培养瓶用于贴壁型细胞：大培养瓶大培养皿滚瓶CellSTACK®多层细胞培养器多层细胞培养瓶E-Cube™系统用于悬浮适应性细胞：旋转瓶摇瓶图2：康宁提供的适用于贴壁细胞和悬浮细胞培养的放大系统。11表1Corning®培养瓶的预期细胞产量及推荐的培养液用量图3：Corning®T-225大培养瓶为培养大量细胞提供了更加简单实用的方法。图4：康宁245mm方形培养皿，可提供500平方厘米的培养面积。康宁培养瓶平均细胞产量*培养液用量25cm22.5x1065-7.5mL75cm27.5x10615-22.5mL150cm21.5x10730-45mL175cm21.75x10735-52.5mL225cm22.25x10745-67.5mL*假设100％铺满培养的平均产量为每平方厘米1x105个细胞。培养皿1877年，RichardPetri在RobertKoch的微生物学实验室任助手时发明了圆形玻璃培养皿。这种简单的Petri玻璃皿作为悬滴培养的无菌容器广泛应用于早期的细胞培养。20世纪60年代，由经过表面处理的聚苯乙烯制成的Petri培养皿开始应用于细胞培养。康宁的圆形细胞培养皿产品有4个型号，直径约从35毫米到150毫米（表2）。150毫米培养皿的培养面积约为148平方厘米。康宁还提供245平方毫米规格的培养皿，其培养面积达500平方厘米，适用于培养更大数量的细胞（图4）。优点可替代培养瓶，并且简单经济可直接接触细胞表面，易于收集（采用刮取方式收集时尤为突出）比培养瓶占用的培养箱空间小可利用显微镜迅速判定细胞生长情况无需其它设备缺点培养量大时工作量大：培养1x109个细胞需20500平方厘米的培养皿开放式设计使培养液外溢及污染事故几率增加表2康宁培养皿的预期细胞产量及推荐的培养液用量康宁培养皿培养面积平均细胞产量培养液用量35mm8cm28.0x1051.6-2.4mL60mm21cm22.1x1064.2-6.3mL100mm55cm25.5x10610-15mL150mm148cm21.48x10730-45mL245mm(平方)500cm25.0x107100-150mL*假设100％铺满培养的平均产量为每平方厘米1x105个细胞。滚瓶旋转式细胞培养的概念由GeorgeGey(1933)提出，他在约翰霍普金斯大学将其用于培养较大数量的贴壁细胞。他的工作主要在玻璃滚管中进行。到20世纪50年代后期，大号玻璃滚瓶已经普遍应用于培养大量细胞，特别是用于病毒疫苗生产(WhittleandKruse；1973；Mather；1998b)。康宁提供4个型号的一次性聚苯乙烯滚瓶，培养面积从490平方厘米到1750平方厘米（图5和表3）。这些滚瓶表面有标准细胞培养表面及能够提高细胞附着力的康宁CellBIND®表面。康宁还提供可重复使用的PYREX®玻璃制滚瓶，具有优异的光学透明度和机械强度。康宁可重复使用型PYREX玻璃滚瓶能够承受反复的干、湿灭菌，培养面积约为670至1330平方厘米。12图5康宁塑料滚瓶的培养面积为490至1750平方厘米。优点避免在培养液中形成梯度，梯度会对细胞生长造成负面影响良好的透气性用于培养大量的贴壁细胞时更加经济：使用与培养瓶相同的培养技术但工作量更小可利用大多数倒置显微镜判定细胞生长情况缺点较之培养瓶和培养皿，占用的培养箱空间更大生产大量细胞时所需工作量为中度：培养1x109个细胞需12，850平方厘米的滚瓶预计需花费至少1500美元来购置用于处理12个瓶的设备。由于不断的旋转瓶子可能导致细胞附着方面的问题，当使用低血清或无血清培养液时，该问题尤为突出。但采用康宁CellBIND®表面能够解决这些问题。表3康宁聚苯乙烯滚瓶的预期细胞产量及推荐的培养液用量康宁滚瓶平均细胞产量培养液用量490cm2滚瓶4.9x107100-150mL850cm2滚瓶8.5x107170-255mL1700cm2滚瓶1.7x108340-510mL1750cm2滚瓶1.75x108350-525mL*假设100％铺满培养的平均产量为每平方厘米1x105个细胞。图6：10层细胞培养器培养面积为6360平方厘米，节省空间和工作量康宁CellSTACK®多层细胞培养器康宁CellSTACK多层细胞培养器为在类似培养瓶等的条件下生产大量贴壁细胞提供了节省空间和工作量的解决方案（图6）。CellSTACK多层细胞培养器有四个型号可供研究实验室使用。单层1-STACK培养器的培养面积为636平方厘米，2层2-STACK培养器的培养面积为1272平方厘米，5层5-STACK培养器的培养面积为3180平方厘米，10层10-STACK培养器的培养面积为6360平方厘米（表4）。第五个型号也是最大的40层细胞培养器,它的培养面积达25440平方厘米，可轻易培养超过2.5x109个细胞。但是，由于其体积较大，需要特殊的操作设备，因此不推荐研究实验室使用。CellSTACK细胞培养器可用于标准细胞培养表面或能够提高细胞附着力的康宁CellBIND®表面。CellSTACK细胞培养器有2个直径为26mm的注液口，能直接通到培养器底部，使无菌注液以及移取培养液及细胞更加方便灵活。对于较大尺寸的CellSTACK多层细胞培养器，可选择附带1/8或3/8直径软管的注液盖进行培养液、溶剂或细胞的直接无菌转移，并且推荐采用蠕动泵压或重力供给的方式转移无菌液体，以确保安全（图7）。较大尺寸的CellSTACK培养器需要些许实践方可熟练操作。为帮助研究人员熟悉CellSTACK培养器的操作程序，请访问康宁公司网站上的技术指导视频，该视频对如何正确使用CellSTACK培养器进行了示范。优点较之培养皿、培养瓶和滚瓶，生产细胞所耗费的工作量更少：培养1x109个细胞仅需2个CellSTACK10层细胞培养器通过增加更多层或更多培养器，使扩大培养更容易较之培养瓶和滚瓶，占用的培养箱空间更小；并可堆叠无需其它设备缺点注液后，大型CellSTACK多层细胞培养器变得很重，加大了操作难度，并且需要坚固的支架13图7：可选的注液盖可使培养液无菌地注入或导出康宁CellSTACK多层细胞培养器对于较大型的CellSTACK®培养器，由于培养液用量较大使移液较困难，因此不如培养瓶、培养皿和滚瓶易于操作由于10层CellSTACK培养器较高，因此使用显微镜查看细胞生长情况较为困难。但是，通过在相同条件下并行实施1层伴随培养可检测细胞生长表4推荐的康宁CellSTACK多层细胞培养器培养液用量培养器培养面积平均细胞产量*培养液用量1-Stack636cm26.36x107130-190mL2-Stack1,272cm21.27x108260-380mL5-Stack3,180cm23.18x108650-900mL10-Stack6,360cm26.36x1081,300-1,900mL40-Stack25,440cm22.54x1095,200-7,200mL*假设100％铺满培养的平均产量为每平方厘米1x105个细胞。图8：10层康宁HYPERFlask多层细胞培养瓶已成功用于细胞增殖（包括贴壁细胞和悬浮细胞），蛋白及病毒生产以及转染。康宁HYPERFlask™多层细胞培养瓶康宁HYPERFla