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第十六章细菌基因工程第一节细菌基因工程的发展现状和发展趋势第二节细菌基因工程的表达系统第三节细菌基因工程的应用第一节细菌基因工程的发展现状和发展趋势一、基因工程的发展简史细菌是单细胞、结构简单的原核微生物;它的物种和代谢类型多样对环境因子敏感;最显著的特征是生长速度快,便于大规模培养,易于进行遗传操作。1973年,波依尔(Boyer)和科恩(Cohen)首次完成外源基因在大肠杆菌中的表达。几年后,第一个基因工程产品——利用构件的基因工程菌生产人胰岛素获得成功,自此进入生物技术的产业时代。细菌的遗传改造也是基因工程中最早,研究最广泛取得实际应用成果最多的领域。1.细菌工程菌与人类药物生产细菌是生产蛋白药物的最好生物反应器,利用细菌基因重组技术可以实现:①对化学方法难以合成的中间体进行合成,从而生产活力更强的衍生物;②是微生物产生新的合成途径,从而获得新的代谢产物;③利用微生物产生的酶对药物进行化学修饰;④生产天然稀有的医用活性多肽或蛋白质。二、细菌基因工程的发展现状未来市场前景广阔的药品将集中在单克隆抗体、反义药物、基因治疗药物、可溶性蛋白质类药物和疫苗5类中,其中单抗最引人注目。⒉细菌工程菌与环境保护利用环境微生物基因工程技术治理环境污染和遏制生态恶化趋势,促进自然资源的可持续利用,是一条最安全和最彻底消除污染的有效途径。它充分利用环境微生物的生物净化、生物转化和生物催化等特性的功能基因,构建基因工程菌进行污染治理、清洁生产和可再生资源利用。与化学、物理方法相比,其效率高、成本低、反应条件温和无二次污染等显著优点,同时还可加强自然环境的自净化能力。美国科学家已用基因工程将带不同降解能力的质粒通过接合转移导入同一细菌中,从而培育出能同时降解4种烃类的“超级工程菌”。⒊细菌工程菌与食品、饲料及其他工业理论上所有发酵食品与食品配料生产菌都可以进行菌种改良,但由于氨基酸、有机酸、维生素、色素、香料等均属于微生物代谢产物,其生产菌的遗传改造较为复杂,目前尚处于研究阶段。但也有少数获得了成功。相对而言,酶制剂的合成所涉及的基因较为简单,适合利用基因工程进行改良。除食品用酶制剂外,细菌基因工程菌也已成功应用于生产其他不同目的的酶,如将葡萄糖转化为高果糖糖浆的葡萄糖异构酶;应用于PCR的耐热DNA聚合酶;用于生产青霉素母核的青霉素酰化酶等。现在的细菌基因工程完全可以做到:①将次级反应转换到主要代谢途径中;②优化产品质量及其产量;③改变初始代谢途径使之能够利用更廉价的原料,或者得到以前未知的新产物;④利用酶的异构体获得新的手性分子。⒋基因工程菌与农业生产近年来基因工程的研究为农业微生物遗传改良提供了有效的手段,成为生命科学领域中最活跃,最具创新的前沿之一。在农业上,世界各国获准进入田间释放的重组微生物占已登记在案的遗传工程菌释放总数的1.15%。其中美国构建了整合外源dctABD基因(提高固氮能力)的转基因重组苜蓿是世界首例通过安全性评价进入有限商品化的工程根瘤菌。20世纪90年代以来,以苏金云芽胞杆菌为龙头的微生物工程杀虫剂迅速发展。由我国学者研制的转ntrC-nifA基因固氮斯氏假单胞菌AC1541和苏云金芽孢杆菌高产广谱工程菌均已通过审批进入安全性评价的商品化生产阶段。随着生物科学的进展,细菌基因工程研究的范围也进一步拓宽。细菌基因工程的重点将会放在细菌资源的发掘和利用上,即从现存丰富的细菌资源中鉴定分离具有杀菌、杀虫、防病、除草、固氮、促生、抗逆、降解污染物、促进养分转化等各种功能的新基因,以及难培养和极端环境微生物资源的开发利用。要注意革新细菌基因工程的生产工艺,在积极促进重组技术发展的同时要高度重视和预防转基因细菌对健康和环境可能存在的风险。三、细菌基因工程菌的发展趋势及前景展望第二节细菌基因工程的表达系统一、细菌基因工程的表达系统细菌基因工程的表达系统由3部分组成:外源基因、表达载体、宿主细菌。外源基因的表达水平不仅与基因的来源、基因的性质以及载体有关,还取决于宿主细胞。要使克隆的外源基因在宿主细胞中高效表达,首先要构筑专门的表达载体(expressionvector),用来控制转录、翻译、蛋白质稳定性以及克隆基因产物的分泌等。大肠杆菌是目前研究最深入,使用最广的基因工程宿主菌。在基因工程领域里,大肠杆菌主要做为外源蛋白超量表达的平台,其主要目的是对不同的蛋白质进行体外超量表达从而可以将目的蛋白用于不同的下游领域,如制备基因工程疫苗,蛋白质组学研究。二、表达载体构建原则表达载体实际上是在克隆载体的基础上装载了用于表达的一些元件(cassette),当外源基因插入到合适位点后,在宿主菌种就可以启动表达。目前在大肠杆菌和酵母中使用的表达载体种类繁多,已形成了成熟的表达系统。但在其他细菌中通常是将目的基因与表达元件(主要是相关的启动子)连接,在装载在特定的克隆载体上,然后导入宿主菌种表达。因此表达载体的构建主要体现在表达元件的选择和利用。对于克隆载体,只要满足在宿主菌中复制和选择要求的载体,都可用作克隆载体。大肠杆菌以外的细菌中应用的克隆载体一般是穿梭载体,都含有大肠杆菌克隆载体的序列,便于在大肠杆菌中扩增和制备。克隆载体可以是质粒载体,也可以是将外源基因整合到染色体上的整合基因载体。⒈启动子的选择通过基因工程手段表达外源基因的目的大致有两种:其一是超量表达,以达到最大限度的活的蛋白质产物。其二是使某个关键基因表达,使宿主菌表现出特殊的性状,或启动其他产物的大量合成。⒉转录的有效性为保证外源基因转录的有效性,在表达载体上应设法除去衰减序列或插入抗转录终止序列以免转录的提前终止,保证mRNA有效的延伸和终止。也可以在终止密码子后增加终止子序列,是转录正确、有效终止。⒊翻译起始的有效性翻译起始是多种成分包括mRNA、16SrRNAfMet-tRNA,核糖体S1蛋白,蛋白合成起始因子之间协同作用的过程。要使翻译起始率最高要满足以下条件:①选用最佳起始密码子AUG;②与SD序列相似或与(5′…AGGAGG…3′)序列完全相同;③除SD序列外,处于起始密码前的两个核氨酸应该是A和U;④在不改变蛋白质功能的前提下,如果在起始密码AUG后的序列是GCAU或AAAA序列,能使翻译效率提高;⑤在翻译起始区不能形成明显的二级结构。⒋翻译的有效终止在基因工程中,一般都采用UAA或一连串的终止密码来有效终止原核细胞的翻译。三、外源基因表达的方式⒈外源基因以融合蛋白形式表达融合表达是指目的基因与编码具有特殊活性的多肽和蛋白质的基因融合,构建成一融合蛋白基因。⒉构建可分泌蛋白,分泌到胞外培养基中通常位于蛋白质N段的称为信号肽的一段氨基酸序列会帮助蛋白通过细胞膜。通过基因操作可以在外源蛋白的N端添加编码信号肽的DNA序列形成一个分泌蛋白。⒊外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达包涵体是致密的不溶性复合物含有大部分的表达蛋白,可以抵抗宿主细胞中蛋白酶的降解,也便于纯化。⒋外源基因在细胞表面的表达(表面展示技术)微生物细胞表面展示(cellsurfacedisplay)技术是把目的蛋白基因序列(外源蛋白)与特定的载体蛋白基因序列(定位序列)融合后导入微生物宿主细胞从而使目的蛋白表达并定位于微生物细胞表面。四、常见细菌表达系统以下主要介绍几种常见的细菌基因工程的表达系统的结构和特点。⒈革兰氏阴性细菌通用的表达载体革兰氏阴性细菌通用的表达载体如pAV10等都是低拷贝数、广宿主质粒Prk290的多克隆位点中插入来源于转座子Tn5末端反向重复序列的一段70bpDNA而构建的。(如图16-1)。来源于Tn5的DNA克隆片断包含两个独立而重叠的启动子,每个启动子分别负责一个Tn5的转录。⒉芽孢杆菌表达系统枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌、无荚膜、能运动的杆状细菌,无致病性,对人畜无害。具有良好的分泌能力,遗传背景清楚,生长迅速,培养条件简便。下面介绍两种应用于枯草芽孢杆菌的载体⑴穿梭载体作为穿梭载体(shuttlevector)应同时具有大肠杆菌载体和枯草芽孢杆菌载体的复制起点例如pDG148-Stu。(图16-2)其结构特点为:①具有乳糖操纵子调节基因lacI及其调控序列;②具有一个杂合启动子;③3个抗性基因作为筛选标记。⑵整合载体能将目的基因整合到宿主的基因组中的载体成为整合载体(integrationvector),一般通过同源重组或转座因子的转座特性实现外源基因整合。pDG1730是典型的枯草芽孢杆菌整合载体,可将外源基因整合到α-淀粉酶基因内部。该载体的基本骨架是大肠杆菌的克隆载体和用于革兰氏阳性细菌的红霉素抗性选择标记基因。⒊微生物细胞表面表达系统微生物细胞表面展示系统的构成包括载体蛋白、目的蛋白和宿主菌株。位于细胞表面的蛋白质都可用于细胞表面展示,常见的载体蛋白有大肠杆菌的外膜蛋白(OmpA和OmpC)和与肽聚糖相关的质蛋白(PAL)等。在大多数细菌表面融合蛋白中,目的蛋白位于融合蛋白的N或C端,有时目的蛋白的断片段也可以在融合蛋白的中间表达(图16-3)。微生物细胞的表面展示技术有广泛的用途,可开发生物制品如活疫苗、细胞催化剂、细胞吸附剂、生物传感器等。但这一领域里仍存在许多问题有待解决如空间阻碍、多亚基蛋白表达、多种外源蛋白的同时表达等问题。第三节细菌基因工程的应用基因工程的实践主要有3种形式:其一:是改造细菌使之性状得到遗传改良;其二:是制作生物反应器,利用细菌来生产某种物质;其三:还有一类是基因工程改造的是细菌本身,但需要的是其产物或代谢产物。下面将简单介绍一些重要的基因工程细菌:一、农业领域的基因工程细菌⒈微生物基因工程农药目前微生物农药主要有微生物杀虫剂、杀菌剂、除草剂等。农业上应用的杀虫基因有3大类,一类是从细菌中分离出来的细菌杀虫剂如苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白ICP基因;另一类是从植物中分离出来的植物抗虫基因,如豇豆胰蛋白酶抑制剂因;此外还有还有其他来源的蝎毒基因aaIT,杆状病毒基因几丁质酶基因等。⑴重组微生物杀虫剂——苏云金芽孢杆菌基因工程及应用苏云金芽孢杆菌是目前国内外产量最大、应用最广的微生物杀虫剂。Bt在其生长过程中产生不同类型的杀虫晶体蛋白,主要作用于鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目等昆虫幼虫,而对人和哺乳动物非常安全。近年来,从Bt中命名的ICP基因已有50大类,250种,其中crylAa、crylAb、crylAc3个基因是杀虫毒力最高的种类,主要存在于库斯塔克亚种(subsp,kurstaki)中。通过基因工程技术改造的Bt主要是为了增强杀毒力、拓宽杀毒范围、延长特效期、克服可能出现的昆虫抗性等。苏云金芽孢杆菌表达系统的构建涉及以下方面:首先确定载体的类型,主要是质粒载体,同时为了复制的稳定,一般用Bt自身质粒的复制区作为载体的复制单元,如穿梭载体pHT304。为了保证基因工程菌环境释放的安全性,要求将载体中的非Bt来源的DNA片段去掉。为此,采用了Bt转座子中的位点特异性重组系统,在携带重组酶基因的辅助质粒帮助下,质粒载体内部发生重组,形成两个质粒,其中携带抗生素抗性基因和大肠杆菌基因片段的质粒由于不能复制而丢失,保留来自Bt的DNA片段。这种载体叫解离载体。(见图16-4)⑵农用抗生素产生菌的遗传操作农用抗生素是由抗生菌发酵所产生的具有农药功能的次级代谢产物,它是由明确分子结构的化学物质。阿维菌素是目前世界上有关生物合成基因簇研究的最深的抗生素之一。⑶杀虫抗病重组微生物许多细菌具有杀死或抑制植物病原菌的作用或具有促进植物生长的作用或在植物的页面或根部具有优势定植能力,将杀虫基因导入这些细菌可以获得改良的杀虫细菌如荧光假单胞菌。⑷其他杀虫抗病微生物1)生物囊杀虫剂将Bt毒素蛋白基因转入到荧光假单胞菌中,使其高效表达并形成伴胞晶体发酵后用化学或物理方法将菌体杀死但不破坏伴胞晶体而且菌体外型保持完整,从而形成一种生物囊制剂。(图16-5)2)基因工程抗病菌放射农杆菌K-84可以产生农杆菌素(agrocin)84,其组分为腺嘌呤脱氧阿拉伯糖苷氨基磷酸盐,可有效防治根癌农杆菌引起的植物根癌病。3)杀虫
本文标题:17-细菌基因工程
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