耿婷婷-基于金磁微粒的化学发光免疫学检测梅毒螺旋体抗体方法的建立(西北大学硕士学位毕业PPT)

LOGO基于金磁微粒的化学发光免疫学检测梅毒螺旋体抗体方法的建立答辩人：耿婷婷导师：陈超崔亚丽GoldMag-AS微米金磁微粒磁内核金外壳金壳层：纳米级金颗粒生物分子固定化容量大非共价偶联：Au-S相互作用疏水静电磁核心:超顺磁性，易于分离一背景介绍国家卫生部传染病法定报告：2005年全国发病人数第五位2007年全国发病人数第三位1985199019952000200504000080000120000160000年份全国梅毒报告病例首例梅毒病例在1979年重庆市报告梅毒螺旋体梅毒在我国已成为一个严峻的公共卫生问题，输血必检项目之一。快速血浆反应素试验;假阴假阳梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验;方便、灵敏度低梅毒螺旋体特异性抗体酶联免疫吸附试验;灵敏度中等梅毒螺旋体核酸检测法；灵敏度高、昂贵梅毒螺旋体特异性抗体化学发光法检测;灵敏度高金磁微粒为载体的化学发光酶免疫检测系统金磁：比表面积大；可自动化操作。化学发光：灵敏度高。二.实验目的1.建立磁酶免化学发光系统检测TP抗体2.血液中TP筛查，提高输血安全性3.血站自动化病原筛查三.实验原理＋化学发光Luminol,H2O2,PIPTMB底物检测吸光度与样品浓度成正比｛＋Ag-Ab-酶复合物四、实验设计及结果分析TP抗原免疫磁珠的制备1磁酶免反应条件的优化2化学发光条件的优化3磁酶免化学发光法建立及方法价4（一）TP抗原免疫磁珠的制备磁粒与抗体偶联封闭，清洗，磁性分离，弃上清保存磁粒中加入抗体（一）TP抗原免疫磁珠的制备1.TP抗原在金磁微粒表面的固定化3004005000.00.20.4121吸光度值波长/nm1---包被前2---包被后TP抗原包被前后的紫外吸收曲线一步偶联：磁粒表面静电作用；疏水相互作用；半胱氨酸残基侧链的巯基与金的作用等。（一）TP抗原免疫磁珠的制备2.优化免疫磁珠的包被时间1min、5min、10min、15min、20min、30min、60min02040600.40.60.81.01.21.4Absorbence(AU)Time(h)20min左右即可完成偶联反应选取30min为最佳包被时间（一）TP抗原免疫磁珠的制备3.选择磁粒的浓度：10µg/孔、30µg/孔、50µg/孔、100µg/孔0204060801000100020003000400050006000过低：阳性值低过高：磁粒不透光影响发光信号选择：30µg/孔磁粒浓度（µg/孔）化学发光信号（一）TP抗原免疫磁珠的制备4.优化封闭反应条件：阳性阴性阳性／阴性4℃过夜1.9061.8840.0800.07324.7737℃2h+4℃过夜1.7451.8150.0300.01972.65常用封闭条件为4C过夜，但实验中发现4C过夜并不适用于金磁微粒的封闭，达不到理想的封闭效果，阴性值较高。磁性微粒4C过夜时基本完全沉降在管底，不能充分反应导致。增加37C震荡2h，明显加强了封闭效果，阴性值较低。（一）TP抗原免疫磁珠的制备5.选择合适封闭剂1％明胶、10％小牛血清、0.5%BSA、5%奶粉、10%奶粉、5％奶粉＋2％小牛血清阳性阴性阳性／阴性1%明胶——————————10%小牛血清1.7651.7230.4960.4353.750.5％BSA2.2992.160.2530.3137.885%奶粉2.2272.3090.1780.14214.1810%奶粉——————————5％奶+2％小牛血清1.7451.8150.030.01972.65（二）TP抗体的免疫学结合双抗原夹心法检测1.选择HPR标记抗原稀释液:20％小牛PBST降低非特异性吸附：加入非特性蛋白加入表面活性剂012345670.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0酶标抗体稀释液吸光度值编号稀释液阴性1PBS0.230±0.0302PBST0.213±0.0503PBST+5%小牛血清0.137±0.0434PBST+10%小牛血清0.115±0.0555PBST+20%小牛血清0.015±0.0306PBST+30%小牛血清0.012±0.040（二）TP抗体的免疫学结合（二）TP抗体的免疫学结合2.优化免疫反应时间包被抗原、待检抗体、酶标抗原的结合是一个动态平衡反应，分别考察反应时间为10、15、25、30、40、50min时的检测结果101520253035404550550.00.20.40.60.81.01.21.41.61.8时间(min)吸光度值阳性对照阴性对照3.选择包被抗原浓度2.5µg/mg、5µg/mg、7.5µg/mg、10µg/mg、12.5µg/mg、15µg/mg×√×抗原包被量（µg/mg）发光信号70140210280350420080160240320（二）TP抗体的免疫学结合2.557.51012.5154.选择HPR标记抗原的浓度2.557.51012.5151:2000PN0.7850.0241.2870.0091.2400.0201.6800.0231.5640.0111.6700.0101:3000PN0.8550.0181.1570.0131.2830.0001.2720.0101.4930.0231.2830.0001:4000PN0.6530.0051.0200.0171.0260.0151.0700.0001.2840.0281.0780.0111:5000PN0.6640.0150.8630.0180.8880.0020.9700.0010.9460.0050.8360.0301:6000PN0.5110.0100.7330.0130.6990.0020.7980.0210.6800.0070.6260.017（二）TP抗体的免疫学结合酶标抗体稀释度抗原包被量最佳工作条件:TP抗原包被量为5µg/mg酶标抗原为1:3000稀释（三）化学发光条件的优化1.选择反应体系Tris阳性阴性发光太弱CBS阳性阴性均发光LuminolH2O2PIP05001000150020000500010000150002000025000abTris体系发光结果相对光子数时间（s）阳性阴性ab05001000150020000500010000150002000025000ab相对光子数时间（s）阳性阴性abCBS体系发光结果PBS阳性发光，阴性不发光PBST阳性发光，阴性不发光05001000150020000500010000150002000025000PBS体系发光结果ab相对光子数时间（s）阳性阴性ab05001000150020000500010000150002000025000ab相对光子数时间（s）阳性阴性abPBST体系发光结果（三）化学发光条件的优化（三）化学发光条件的优化2.缓冲体系中Tween-20浓度的影响0.0％0.05％0.1％0.15％0.2％0.3％500100015002000250030003500Tween20浓度(v/v)发光信号吐温0.3％0.2％0.15％0.1％0.05％0.0％阳性75922852369296131661989阴性383838304630空白15815152315发光剂7676918411484（三）化学发光条件的优化3.选择pH值pH6.577.588.5阳性129592280946551352阴性883011499空白8882323发光剂88815152pH值发光信号6.57.07.58.08.5010002000300040005000（三）化学发光条件的优化4.选择luminol浓度1.25×10-31×10-30.75×10-30.5×10-30.25×10-3阳性2856534487332122933921648阴性7684535330空白3838382315发光剂3112581671441215×10－3、1×10-3、2×10-4、4×10-51.25×10-3、1×10-3、0.75×10-3、0.5×10-3、0.25×10-32×10－3、1.5×10-3、1×10-4、0.5×10-50.00.30.60.91.20500010000150002000025000300003500040000Luminol浓度（mol/L）相对光子数（三）化学发光条件的优化5.选择H2O2浓度1.81.51.20.90.60.3阳性180019132392262723311192阴性463023232323空白38382315158发光剂5361613830152.4、2.0、1.6、1.2、0.8、0.41.8、1.5、1.2、0.9、0.6、0.31.4、1.2、1、0.8、0.6、0.4H2O2浓度(μl/mL)发光信号0.00.30.60.91.21.51.8050010001500200025003000（三）化学发光条件的优化6.选择PIP浓度6×10-35×10-34×10-33×10-32×10-31×10-3阳性249129013121321228701450阴性383838304630空白1588232312发光剂6161658484911×10－2、2×10-3、4×10-4、8×10-5、1.6×10-56×10-3、5×10-3、4×10-3、3×10-3、2×10-3、1×10-510×10-3、5×10-3、2.5×10-3、1.25×10-3、0.6×10-3PIP浓度(mol/mL)发光信号0.0000.0010.0020.0030.0040.0050.00601000200030004000＋化学发光Luminol,H2O2,PIP＋Ag-Ab-酶复合物（四）磁酶免化学发光方法的建立及评价1.磁酶免化学发光法标准曲线测定0.0000.0020.0040.0060.0080.0100100020003000R2=0.9988阳性血清梯度稀释发光信号（四）磁酶免化学发光法的建立及评价将阳性血清梯度稀释，线性关系良好y=10406x-4.619（四）磁酶免化学发光法的建立及评价2.磁酶免化学发光法与其他方法灵敏度的比较以金磁微粒为固相载体进行酶免检测，灵敏度提高2倍。结合化学发光检测，灵敏度可提高16倍。阳性血清稀释倍数检测结果商品化试剂盒磁酶免法磁酶免化学发光法1:25+++1:50+++1:100+++1:200+++1:400-++1:800-+-+1:1600--+1:3200--+1:6400--+-1:12800---（四）磁酶免化学发光法的建立及评价3.磁酶免化学发光检测方法的精密度在线性范围内选取1:400稀释的阳性血清，重复测定11次，计算测定值的相对标准偏差RSD=5.5%。0246810120200040006000800010000磁分离化学发光免疫法检测阳性样品11次重复测定相对光子数五：全文总结优化磁酶免反应条件优化化学发光条件制备免疫磁珠•包被时间的选择•选择抗原包被量•选择磁粒用量•优化封闭反应条件•封闭剂的选择•HPR标记抗原稀释液的选择•优化免疫反应时间•选择抗原包被浓度•选择HPR标记抗原的浓度•选择反应体系•缓冲体系中Tween-20浓度•选择pH值•选择luminol浓度•选择PIP浓度•选择H2O2浓度方法评价•标准曲线测定•与其他方法灵敏度的比较•法精密度的测定全文总结TP抗体的磁酶免化学发光检测法制备免疫磁珠方法评价优化免疫学条件优化化学发光条件操作简单灵敏度高可自动化操作致谢感谢陈超教授、崔亚丽教授、彭明丽副教授对我学业的悉心指导和辛勤培养。感谢磁性微粒组全体员工与同学对我无私的帮助。感谢国微中心全体成员对我工作的支持。感谢我的父母这么多年在我背后默默的支持与关怀。感谢各位评委老师。LOGO