BD-流式基础知识-qj

流式细胞术流式细胞术？对于处在流动状态中的细胞或颗粒各项特性进行检测FlowCytometryinmotioncellmeasure♠特点：速度快(≥10000cells/s)特异性强，灵敏度高(MRD:1/10000)多参数分析、活细胞分选♠研究对象:单细胞悬液可检测的样本种类多样：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、藻类等流式细胞术FACSVerseAccuriC6LSRforttesa现代流式细胞仪(Flowcytometer)FL2PESSCFSC电子系统计算机系统FL3PerCP,Cy5FL1FITCLightdetectors液流系统光学系统laser流式细胞仪工作流程流式细胞仪的构造1.细胞样本成单列依次通过光检测区液流系统2.激发并收集各种光信号3.光信号转换成电信号，数字化处理4.数字信号传入计算机光学系统电子系统计算机系统分选系统5.活细胞分选液流系统流动室（Flowcell）LaserSample流体动力学聚焦鞘液：sheathSheathSampleStreamCell—样本流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法—鞘液压力恒定，流速不变—通过调节样本压力调节样本进样速率液流系统液流驱动系统调节样本进样速度样本流与鞘液压力差改变，样本流直径改变，细胞间距改变10psi10psi10psi10psi10psi10.2psi10.4psi10.8psi压力差样本流进样速度分辨率HiLoMedLowpressureHighpressure细胞周期FL301024204830724096Count300280260240220200180160140120100806040200.G0/G1CV=2.42G2/MSphaseG0/G1FL301024204830724096Count340320300280260240220200180160140120100806040200GO/G1CV=7.79.GO/G1CV=7.79流式细胞仪的构造1.细胞样本成单列依次通过光检测区2.激发并收集各种光信号液流系统光学系统光学系统激发光学系统:激发光源—激光透镜和反射镜—将激光引导到检测区域接收光学系统:滤光片等—将产生的光信号引导到对应的光学接收器激发光学系统:将激光引导到检测区域，产生光信号激光单波长高强度高稳定488nmblue633nmred405nmvioletLightSignals光学棱镜流式细胞仪检测信号InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluidLaserbeam1.散射光信号2.染色过细胞的荧光信号前向角散射光(FSC)侧向角散射光(SSC)360度立体角通过流式细胞仪我们可以得到---♠相对细胞大小（前向角散射光-FSC）♠相对细胞颗粒密度和内部复杂度（侧向角散射光-SSC）♠染色过细胞的相对荧光强度（荧光-Fluoresentlight）前向角散射光（FSC）Forward(AngleLight)Scatter♠FSC信号收集方向与激光束相平行♠FSC与被测细胞或颗粒相对大小及表面积相关FALSSensorLaser前向角散射光（FSC）FSCisproportionaltorelativesize&cell-surfacearea侧向角散射光（SSC）Side-scatteredlight(90DegreeLightScatter)♠SSC信号收集方向与激光束相垂直（90°）♠SSC与被测细胞或颗粒内部颗粒度和结构复杂度相关FALSSensor90LSSensorLaser侧向角散射光（SSC）SSCisproportionaltocellgranularityorinternalcomplexity.散射光（FSC&SSC）散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异♠通常使用“散点图”来看散射光信号♠散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据eg.MajorleucocytesubpopulationscanbedifferentiatedusingFSCandSSC.Figure:CellsubpopulationsbasedonFSCvsSSCDualParameterdot-plot流式细胞仪检测信号InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluidLaserbeam1.散射光信号2.染色过细胞的荧光信号自发荧光信号特异性荧光信号荧光信号（Fluoresentlight）双色荧光散点图荧光强度（Fluoresenceintensity）♠荧光信号的强度代表被测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质浓度。荧光信号（Fluoresentlight）荧光信号收集方向与激光束相垂直（90°）FreqFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4)接收光学系统接收光学系统：接收光信号,并将光信号引导到对应的接收器中光学滤片460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50LongpassShortpassBandpass(500+/-25)FACSCalibur光路图每个探测器前往往为BP，所以每个探测器只能接收特定波长范围的光信号FL1:515nm-545nm光学探测器光电二极管---FSCPhotodiodes光电倍增管---SSC&FluoresencePhotomultipliertubes(PMTs)光电转换器：将光信号转换为电信号流式细胞仪的构造3.光信号转换成电信号，数字化处理1.细胞样本成单列依次通过光检测区2.激发并收集各种光信号液流系统光学系统电子系统电子系统将光信号转化为电信号（模拟信号）将模拟信号转化为数字信号计算每个脉冲峰和计算机连接以传出数据将光信号成比例的转换成电信号，并进行数字化处理后传入计算机光信号转换为电信号LinearAmplificationLogAmplificationorVoltageTimePMT电压电信号电压脉冲的产生—模拟信号LaserLaserLaserTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage1当微粒通过激光束时，脉冲开始。此时，激光强度和信号强度都很低。2当微粒达到激光束中间时，脉冲达到最大强度或者高度，此时激光束和信号强度都最高。此时测定峰值强度或者脉冲高度。3当微粒离开激光束时，脉冲减弱。计算一个电压脉冲峰TimeVoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0—面积是对荧光光通量进行积分测量的结果—宽度=面积/高度，与颗粒通过激光照射区的时间成正比—特定参数可选择面积、宽度信号（DNA含量分析）模拟信号转换为数字信号流式细胞仪的构造3.光信号转换成电信号，数字化处理4.数字信号传入计算机1.细胞样本成单列依次通过光检测区2.激发并收集各种光信号液流系统光学系统电子系统计算机系统数据的获取表现专业软件中的数据表现单参数直方图双参数散点图三维点图等高图密度图设门（Gating）平均荧光强度百分比流式细胞仪的构造1.细胞样本成单列依次通过光检测区2.激发并收集各种光信号3.光信号转换成电信号，数字化处理4.数字信号传入计算机液流系统光学系统电子系统计算机系统分选系统5.活细胞分选分选系统检测加电偏转收集ReviewSortingReviewQuestions在仪器设置中调高Red参数的电压，左图中群体会发生什么变化？如何进行流式细胞实验？1.样本处理2.荧光染料的选择3.染色4.数据收集和分析1.样本处理单细胞悬液—细胞悬液：–直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小–灌洗液、体腔积液–培养细胞、细胞系—实体组织：–病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本–针吸组织：新鲜样本2.选择合适的荧光染料★必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发★激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内★根据抗原表达强弱选择荧光抗体★荧光素光谱的重叠应当尽量减少荧光信号（Fluoresentlight）Fluorescein(FITC)400nm500nm600nm700nmWavelengthExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE)Allophycocyanin(APC)633nm红激光ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm2.选择合适的荧光染料★必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发★激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内★根据抗原表达强弱选择荧光抗体★荧光素光谱的重叠应当尽量减少FACSCalibur光路图每个探测器前往往为BP，所以每个探测器只能接收特定波长范围的光信号FL1:515nm-545nm2.选择合适的荧光染料★必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发★激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内★根据抗原表达强弱选择荧光抗体★荧光素光谱的重叠应当尽量减少2.选择合适的荧光染料★必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发★激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内★根据抗原表达强弱选择荧光抗体★荧光素光谱的重叠应当尽量减少荧光光谱重叠与补偿530/30585/42利用电子术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”荧光补偿补偿前补偿后2.选择合适的荧光染料★必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发★激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内★根据抗原表达强弱选择荧光抗体★荧光素光谱的重叠应当尽量减少染色—体积—温度—孵育时间—对照4.数据收集和分析1)画图（直方图，散点图）2)调整仪器设置到合适的状态3)寻找目标细胞4)我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？仪器设置调节1.用阴性细胞调整仪器PMT电压2.用单染色的细胞调节仪器补偿二原则：同型对照（Isotypecontrol）—例：一个双色染色的实验抗体AFITC，抗体BPE对应的同型对照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1FITC,IgG1PE单阳性对照：FITC:细胞加上AbAFITCPE:细胞加上AbBPE同型抗体为没有特异性，与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2.同型对照就是使用同型抗体进行平行实验，反映待测样本对抗体非特异性结合水平。数据分析—设门—设定阴性与阳性群体的界限—确定阳性与阴性细胞群体—统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数如何设定阴性与阳性的界限直方图散点图Thanks!