高效液相色谱法工作原理

第十六章第十六章第十六章第十六章高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法一一一一、、、、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点二二二二、、、、流程及主要部件流程及主要部件流程及主要部件流程及主要部件三三三三、、、、影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素四四四四、、、、高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型概述概述概述概述高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法（（（（HPLCHPLCHPLCHPLC））））是是是是20202020世纪世纪世纪世纪60606060年代末年代末年代末年代末70707070年代初发展起来的一种新型分离年代初发展起来的一种新型分离年代初发展起来的一种新型分离年代初发展起来的一种新型分离分析技术分析技术分析技术分析技术，，，，随着不断改进与发展随着不断改进与发展随着不断改进与发展随着不断改进与发展，，，，目前已目前已目前已目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要成为应用极为广泛的化学分离分析的重要成为应用极为广泛的化学分离分析的重要成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段手段手段手段。。。。一一一一、、、、液相色谱分离原理及分类液相色谱分离原理及分类液相色谱分离原理及分类液相色谱分离原理及分类和气相色谱一样和气相色谱一样和气相色谱一样和气相色谱一样，，，，液相色谱分离系统也液相色谱分离系统也液相色谱分离系统也液相色谱分离系统也由两相由两相由两相由两相——固定相和流动相组成固定相和流动相组成固定相和流动相组成固定相和流动相组成。。。。液相液相液相液相色谱的固定相可以是吸附剂色谱的固定相可以是吸附剂色谱的固定相可以是吸附剂色谱的固定相可以是吸附剂、、、、化学键合化学键合化学键合化学键合固定相固定相固定相固定相（（（（或在惰性载体表面涂上一层液或在惰性载体表面涂上一层液或在惰性载体表面涂上一层液或在惰性载体表面涂上一层液膜膜膜膜）、）、）、）、离子交换树脂或多孔性凝胶离子交换树脂或多孔性凝胶离子交换树脂或多孔性凝胶离子交换树脂或多孔性凝胶；；；；流流流流动相是各种溶剂动相是各种溶剂动相是各种溶剂动相是各种溶剂。。。。被分离混合物由流动相液体推动进被分离混合物由流动相液体推动进被分离混合物由流动相液体推动进被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱入色谱柱入色谱柱入色谱柱。。。。根据根据根据根据各组分在固定相及流动各组分在固定相及流动各组分在固定相及流动各组分在固定相及流动相中的吸附能力相中的吸附能力相中的吸附能力相中的吸附能力、、、、分配系数分配系数分配系数分配系数、、、、离子交换离子交换离子交换离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离作用或分子尺寸大小的差异进行分离作用或分子尺寸大小的差异进行分离作用或分子尺寸大小的差异进行分离。。。。色谱分离的实质色谱分离的实质色谱分离的实质色谱分离的实质是样品分子是样品分子是样品分子是样品分子（（（（以下称以下称以下称以下称溶质溶质溶质溶质））））与溶与溶与溶与溶剂剂剂剂（（（（即流动相或洗脱液即流动相或洗脱液即流动相或洗脱液即流动相或洗脱液））））以以以以及固定相分子间的作用及固定相分子间的作用及固定相分子间的作用及固定相分子间的作用，，，，作用力的大作用力的大作用力的大作用力的大小小小小，，，，决定色谱过程的保留行为决定色谱过程的保留行为决定色谱过程的保留行为决定色谱过程的保留行为。。。。根据分离机制不同根据分离机制不同根据分离机制不同根据分离机制不同，，，，液相色谱可分液相色谱可分液相色谱可分液相色谱可分为为为为：：：：液固吸附色谱液固吸附色谱液固吸附色谱液固吸附色谱、、、、液液分配色谱液液分配色谱液液分配色谱液液分配色谱、、、、化化化化合键合色谱合键合色谱合键合色谱合键合色谱、、、、离子交换色谱以及分子排离子交换色谱以及分子排离子交换色谱以及分子排离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型阻色谱等类型阻色谱等类型阻色谱等类型。它是在经典液相色谱基础上它是在经典液相色谱基础上它是在经典液相色谱基础上它是在经典液相色谱基础上，，，，引入了气引入了气引入了气引入了气相色谱的理论相色谱的理论相色谱的理论相色谱的理论，，，，在技术上在技术上在技术上在技术上采用了高压采用了高压采用了高压采用了高压泵泵泵泵、、、、高效固定相和高灵敏度检测器高效固定相和高灵敏度检测器高效固定相和高灵敏度检测器高效固定相和高灵敏度检测器，，，，因因因因而具备而具备而具备而具备速度快速度快速度快速度快、、、、效率高效率高效率高效率高、、、、灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高、、、、操操操操作自动化的特点作自动化的特点作自动化的特点作自动化的特点。。。。为了更好地了解高效为了更好地了解高效为了更好地了解高效为了更好地了解高效液相色谱法优越性液相色谱法优越性液相色谱法优越性液相色谱法优越性，，，，现从两方面进行比现从两方面进行比现从两方面进行比现从两方面进行比较较较较：：：：高效液相色谱法比起经典液相色谱高效液相色谱法比起经典液相色谱高效液相色谱法比起经典液相色谱高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于法的最大优点在于法的最大优点在于法的最大优点在于高速高速高速高速、、、、高效高效高效高效、、、、高灵敏高灵敏高灵敏高灵敏度度度度、、、、高自动化高自动化高自动化高自动化。。。。高速是指在分析速度上高速是指在分析速度上高速是指在分析速度上高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍比经典液相色谱法快数百倍比经典液相色谱法快数百倍比经典液相色谱法快数百倍。。。。由于经典由于经典由于经典由于经典色谱是重力加料色谱是重力加料色谱是重力加料色谱是重力加料，，，，流出速度极慢流出速度极慢流出速度极慢流出速度极慢；；；；而高而高而高而高效液相色谱配备了高压输液设备效液相色谱配备了高压输液设备效液相色谱配备了高压输液设备效液相色谱配备了高压输液设备，，，，流速流速流速流速最高可达最高可达最高可达最高可达103cm·min-1。。。。高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法例如分离苯的羟基化合物例如分离苯的羟基化合物例如分离苯的羟基化合物例如分离苯的羟基化合物，，，，7个组分个组分个组分个组分只需只需只需只需1min就可完成就可完成就可完成就可完成。。。。对氨基酸分离对氨基酸分离对氨基酸分离对氨基酸分离，，，，用经典色谱法用经典色谱法用经典色谱法用经典色谱法，，，，柱长约柱长约柱长约柱长约170cm，，，，柱径柱径柱径柱径0.9cm，，，，流动相速度为流动相速度为流动相速度为流动相速度为30cm3·h-1，，，，需用需用需用需用20多小时才能多小时才能多小时才能多小时才能分离出分离出分离出分离出20种氨基酸种氨基酸种氨基酸种氨基酸；；；；而用高效液相色谱法而用高效液相色谱法而用高效液相色谱法而用高效液相色谱法，，，，只需只需只需只需lh之内即可完成之内即可完成之内即可完成之内即可完成。。。。又如用又如用又如用又如用25cm××××0.46cm的的的的Lichrosorb－－－－ODS(5μμμμ)的柱的柱的柱的柱，，，，采用梯度洗脱采用梯度洗脱采用梯度洗脱采用梯度洗脱，，，，可在可在可在可在不到不到不到不到0.5h内分离出尿中内分离出尿中内分离出尿中内分离出尿中104个组分个组分个组分个组分。。。。（（（（llll））））气相色谱法气相色谱法气相色谱法气相色谱法分析对象分析对象分析对象分析对象只限于分只限于分只限于分只限于分析气体和沸点较低的化合物析气体和沸点较低的化合物析气体和沸点较低的化合物析气体和沸点较低的化合物，，，，它们仅占它们仅占它们仅占它们仅占有机物总数的有机物总数的有机物总数的有机物总数的20202020％。％。％。％。对于占有机物总数对于占有机物总数对于占有机物总数对于占有机物总数近近近近80808080％％％％的那些高沸点的那些高沸点的那些高沸点的那些高沸点、、、、热稳热稳热稳热稳定性差定性差定性差定性差、、、、摩摩摩摩尔尔尔尔质质质质量量量量大的物质大的物质大的物质大的物质，，，，目前主要采用高效液目前主要采用高效液目前主要采用高效液目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析相色谱法进行分离和分析相色谱法进行分离和分析相色谱法进行分离和分析。。。。高效液相色谱法与气相色谱法高效液相色谱法与气相色谱法高效液相色谱法与气相色谱法高效液相色谱法与气相色谱法（（（（2））））液相色谱能完成液相色谱能完成液相色谱能完成液相色谱能完成难难难难度较高的分离度较高的分离度较高的分离度较高的分离工工工工作作作作，，，，因为因为因为因为：：：：①①①①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的气相色谱的流动相载气是色谱惰性的气相色谱的流动相载气是色谱惰性的气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，，，，不不不不参参参参与分配与分配与分配与分配平衡平衡平衡平衡过程过程过程过程，，，，与样品分子与样品分子与样品分子与样品分子无亲无亲无亲无亲和和和和作用作用作用作用，，，，样品分子只与固定相相样品分子只与固定相相样品分子只与固定相相样品分子只与固定相相互互互互作用作用作用作用。。。。而而而而在液相色谱中在液相色谱中在液相色谱中在液相色谱中，，，，流动相液体也与固定相流动相液体也与固定相流动相液体也与固定相流动相液体也与固定相争争争争夺夺夺夺样品分子样品分子样品分子样品分子，，，，为为为为提提提提高高高高选择选择选择选择性性性性增增增增加了一个因加了一个因加了一个因加了一个因素素素素。。。。也可也可也可也可选选选选用不同比例的两种或两种以上用不同比例的两种或两种以上用不同比例的两种或两种以上用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相的液体作流动相的液体作流动相的液体作流动相，，，，增增增增大分离的大分离的大分离的大分离的选择选择选择选择性性性性。。。。②②②②液相色谱固定相类型多液相色谱固定相类型多液相色谱固定相类型多液相色谱固定相类型多，，，，如离子交换色如离子交换色如离子交换色如离子交换色谱和排阻色谱谱和排阻色谱谱和排阻色谱谱和排阻色谱。。。。等等等等，，，，作为分析时作为分析时作为分析时作为分析时选择余选择余选择余选择余地大地大地大地大；；；；而气相色谱而气相色谱而气相色谱而气相色谱并并并并不可能的不可能的不可能的不可能的。。。。③③③③液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱通常通常通常通常在在在在室温室温室温室温下操作下操作下操作下操作，，，，较低的较低的较低的较低的温温温温度度度度，，，，一一一一般般般般有有有有利利利利于色谱分离于色谱分离于色谱分离于色谱分离条条条条件的件的件的件的选选选选择择择择。。。。（（（（3））））由于液体的由于液体的由于液体的由于液体的扩散扩散扩散扩散性比气体的小性比气体的小性比气体的小性比气体的小105倍倍倍倍，，，，因因因因此此此此，，，，溶质在液相中的溶质在液相中的溶质在液相中的溶质在液相中的传传传传质速率质速率质速率质速率慢慢慢慢，，，，柱柱柱柱外外外外效应就效应就效应就效应就显得显得显得显得特特特特别别别别重要重要重要重要；；；；而在气而在气而在气而在气相色谱中相色谱中相色谱中相色谱中，，，，柱柱柱柱外区域扩张外区域扩张外区域扩张外区域扩张可以可以可以可以忽略忽略忽略忽略不不不不计计计计。。。。（（（（4））））液相色谱中制备样品液相色谱中制备样品液相色谱中制备样品液相色谱中制备样品简单简单简单简单，，，，回收回收回收回收样品也比较样品也比较样品也比较样品也比较容易容易容易容易，，，，而而而而且回收且回收且回收且回收是定是定是定是定量量量量的的的的，，，，适适适适合于大合于大合于大合于大量量量量制备制备制备制备。。。。但但但但液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱尚缺乏通尚缺乏通尚缺乏通尚缺乏通用的检测器用的检测器用的检测器用的检测器，，，，仪仪仪仪器比较器比