western-blot04------制胶这件小事

说到WesternBlotting，估计所有技术员都会联想到蓝底上的黑色条带，或者是仪器扫描的白底黑条图片。经过了漫长的实验流程，得到的会是清晰的、符合实验理论的完美结果，或者更多的是其他让自己略感失望的结局。比起其他分子生物学实验，WesternBlotting实验似乎更加冗长、更加考验技术，从实验准备，到最后曝光结果，任何一个步骤的丝毫疏忽，结果可能就差之千里。在这里，BioTNT我先放下之后繁琐复杂的操作步骤，和大家聊聊WesternBlotting实验基础中的基础——制胶。不要小看制胶这件小事哦！Western实验是从电泳跑胶开始的（之前的样本处理算在实验准备里哈），因此电泳跑胶的质量直接影响到最终的实验结果，其中，聚丙烯酰胺凝胶的质量起到了决定性的作用。要是在制胶时出现了瑕疵，会有怎样的结果呢？好不容易配好的分离胶在凝固时居然只剩下了一半！没法用了，只能重制！那你一定是个新手，漏胶什么的最容易出现了。曝光结束，发现条带不在同一水平线上，原本应在同一kDa值的条带却上上下下如同波浪线一般，好吧，那这块儿胶在配制的时候一定不匀。悲剧，从头开始吧！还是在曝光结束，发现在垂直方向上有那么一小条出现了空白（或者说是黑色曝光细斑），不巧的，影响到了目的条带。嗯，那就是你在制胶的时候混了那么一点儿小气泡进去，蛋白们在跑胶时碰到气泡都绕道啦！继续的，曝光结束，发现目的条带和非特异条带挤作一团，难舍难分，没法作为数据，这种情况比较复杂，可能原因是电泳时间不够，抗体质量不佳，样本中的蛋白过量，etc.但是，你有没有想过，可能是你选错了胶的浓度？还有诸如胶不凝、曝光条带大小不均、拔泳梳时坏胶、上样电泳时样本溢出等等问题，可能都与你制胶的小细节有问题哦！怎么样，小瞧了制胶，吃大亏了吧！还是好好的、严肃的来看待制胶这个问题吧！说到这个制胶，很多的少年们还不知道制的是什么胶吧（啊喂，前面说了，是聚丙烯酰胺凝胶啦！）？，在分子生物学实验中，常用的电泳胶有两种：琼脂糖凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶。这两个凝胶有什么区别呢？咳咳，本质区别啊！琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。其孔径相当大，现广泛应用于核酸的研究中。也就是说，琼脂糖凝胶，可以区分的是电荷量，以及大分子量的物质。着重介绍一下我们的聚丙烯酰胺凝胶，他是聚丙烯酰胺聚合交联向成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。在电泳前，通过向样品加入还原剂(打开蛋白质的二硫键)和过量SDS（阴离子去垢剂），使蛋白质变性解聚，并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖掉蛋白质之间原有电荷的差异，使各种蛋白质的电荷／质量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。也就是说，聚丙烯酰胺凝胶，可以区分的是分子量相对较小的物质。那么，聚丙烯酰胺凝胶里到底有些什么成分呢？首先要说明的是，电泳时的聚丙烯酰胺凝胶其实是由两块（或者以上）不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶组合而成的，他们分别称为浓缩胶及分离胶，浓缩胶是4%聚丙烯酰胺凝胶，主要作用是将样本在上样时的高度差缩小，使得所有的蛋白能够处在同一起跑线上，进而得到更美观、更科学的数据。在部分实验室，并不用浓缩胶，这一做法不值得提倡哦！分离胶是真正的分子筛，通过聚丙烯酰胺形成的立体孔道，对不同分子量大小的蛋白进行分离。在一些实验室，分离胶选用的是梯度胶，即为使用不同浓度的胶依次叠加，所得到的胶分离效果更佳，不过，制胶的步骤多了，失败的可能性也大大增加哦！对于新手来说绝不推荐！分离胶和浓缩胶中的成分基本相同，都是由以下这些组成：超纯水、聚丙烯酰胺、Tris盐酸、SDS、AP、TEMED。分别来说说它们的作用吧！超纯水：…不说了聚丙烯酰胺：由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)按一定比例混合而成，分子筛作用，分离不同分子量大小的蛋白。顺便一提哦，丙烯酰胺是剧神经毒哦！操作时候可要特别当心啊！聚丙烯酰胺毒性相对较小，但是还是注意些吧！Tris盐酸：缓冲液，保证胶的pH值正常。SDS：十二烷基硫酸钠，阴离子去垢剂，打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖各种蛋白分子间天然的电荷差。AP：过硫酸铵，催化剂，加速聚丙烯酰胺形成立体结构，即加速凝胶。TEMED：N，N，N’，N’四甲基乙二胺，催化剂，加速聚丙烯酰胺形成立体结构，即加速凝胶。在了解了这么多基本知识之后，我们终于可以制胶了吧！嘿，不！慢着！先想想，我们要制多少浓度的胶呢？不同的聚丙烯酰胺浓度所产生的分子筛作用不同，对之后的实验也会产生影响。常见的聚丙烯酰胺凝胶浓度有：8%、10%、12%（什么？梯度胶，咳咳，这里就不说了哈），视具体情况而定。不同浓度的分离胶对相同范围分子量大小的蛋白有不同的分离作用，由此可得出对不同分子量蛋白所适用的相应浓度的分离胶。经过我们大量的实验数据得到，8%聚丙烯酰胺凝胶对35kDa以上蛋白的分离效果较好，对35kDa以下蛋白的分离效果较差；10%聚丙烯酰胺凝胶对15-170kDa蛋白的分离效果普通，对15kDa以下蛋白分离效果较差；12%聚丙烯酰胺凝胶对45kDa以下蛋白分离效果较好，对45kDa以上蛋白分离效果较差。Western实验中，绝大部分蛋白的分子量在20-100kDa，因此在没有特殊要求的情况下使用10%的聚丙烯酰胺凝胶，可以基本保证不同分子量蛋白的分离以及对电泳蛋白的最高利用。好了好了，我们还是制胶吧！制胶这事儿其实真是个手艺活儿，需要一定的熟练程度。刚开始制胶，制出了一两块儿废胶，大家大可不必放在心上，想当年，BioTNT可足足制了一天，才制出能够进行实验的凝胶哟！漏胶往往是每位技术员朋友最先遇到的问题，虽然制胶的制胶槽按照购买公司的不同也有所差别，但是总的来说大同小异，掌握手上的力度最为重要。对于制胶的新手，个人建议先别急着制胶，先把制胶器组装起来，往玻璃槽中加水，等过25分钟（即为胶凝固的时间），直到漏水现象基本解决后，就可以着手制胶了，一般来说，不漏水了，漏胶的可能就基本消除啦。在组装制胶器的过程中，要经常注意玻璃板底是否和制胶槽底是否平整，一旦不平整，漏胶的可能性就很大了哟。怎样才能平整呢？这就是力度问题啦，用力不能太轻，同样也不能过猛，太轻封不住，太猛就容易造成形变，这个度嘛，最后还是要自己找啊！BioTNT的同事也告诉我呀，有条件的实验室，可以在制作聚丙烯酰胺凝胶前，先往玻璃槽里加一些琼脂糖凝胶封个底，个人觉得也是不错的建议哟！你以为不漏胶了，就算成功了？no，no，no！你还差得远呢！不要忘了，你刚刚到制胶这一步哦！接下来，我就提几个需要注意的点，剩下的大家就自己加油吧！首先，在制备液态胶的时候，需要格外小心，不要加错或者漏加什么东西哦，配制的母液也尽量是新鲜配制，不要使用已经保存很多时间的。配制好的液态胶需要充分的混匀，推荐的方式是上下温和颠倒。之前介绍过，AP以及TEMED是聚丙烯酰胺的助凝剂，要是一不小心没加，那你的胶可就凝不起来了哟（据说没有这两个东西凝胶要等个把星期哦，反正BioTNT是没等过）！其次，在加胶时，注意尽量不要加入气泡。SDS是去垢剂，在混匀过程容易产生气泡，而在胶中混入气泡可是非常致命的哟！当在混匀时，手法要温和，混匀完后，将液态胶静置15秒左右再进行加胶，以使液态胶中的微小气泡上浮。另外，加胶时可以使用两档吸一档打的方式，防止在打完胶后打入空气，同时也应该注意枪头是否有气泡。第三，压胶时滴加压胶液应均匀、缓慢。压胶是制胶时不可缺少的一步，平整的分离胶有助于得到平整的条带。常见的压胶液是异丙醇，也可以用超纯水替代。压胶不慎不仅不能压平分离胶，反而会使分离胶凹凸不平，甚至直接溶入分离胶，造成胶的不匀。在滴加压胶液时，应贴住玻璃板，由左至右缓慢滴加，控制每一滴压胶液的体积。第四，应注意掌握凝胶的时间及温度。凝胶是一个化学反应，与温度、时间有一定关系。一般来说，当室温在10-25℃时，凝胶需要25分钟，室温较高时可酌情减少时间，相反的，室温较低时需适当增加。凝胶时间不足会造成胶不凝，而时间过长会使得拔泳道变得困难。最后，在制作泳道时，要保持泳梳的垂直上下。在插泳梳时，将泳梳斜插会使得拔出困难，甚至造成坏胶（可能很大哟）。在拔泳梳时，斜拔会撬开玻璃板，这样上样可能会漏样哦！其次，泳道要保持一定的高度，即加入的液态分离胶一定要足量，否则上样时样本溢出可就是板上钉钉啦！对了对了，拔梳子的时候不要忘记加电泳缓冲液哦！嗯？成功了？恭喜你啦！那么治好的胶可以长时间存放么？可以，但不是那么的长哦，强烈建议当日使用，要是必须延时存放，需加入足量（可以没过胶体）的电泳缓冲液，放入4℃冰箱，注意！DONOTFREEZEN！要是在使用的时候发现你的电泳缓冲液结冰了，你可就中招了，重新融化后的胶在上样时非常容易漏样哦！也就是说，在大冬天时，不但不应该冷藏，反而应该保温！同时，建议的保存期不应超过1周，每天都应补充电泳缓冲液保持胶体湿润。制完了胶，也就终于迈出了万里长征的第一步，接下来，才是正式的Western实验哦，不过，好的开始是成功的一半，有了一块好胶，成功的实验也就有了良好的基础，祝各位实验顺利，得到自己希望的结果吧！相关试剂：制胶（小量推荐）SDS-PAGE凝胶配制试剂盒A20120A030050T280制胶（超过50张膜--大量推荐）过硫酸胺Ammoniumpersulfate(APS)A20120A030125G150A8090-25Tween20A20120A0302100ml30国产甲叉双丙稀酰胺（Bic）A20120A0303100g150M8200-100丙稀酰胺（Acr）A20120A0304500g40国产TEMED四甲基乙二胺A20120A030510ml42T8090-100Tris•HCl1.5mol/L（pH8.8）A20120A0203100ml60Tris•HCl0.5mol/L（pH6.8）A20120A0204100ml60