Western-blot详细操作过程

WesternBlotWesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。实验器材和试剂：一．蛋白提取试剂1.10%SDS裂解液：称取10gSDS粉末加入双蒸水至90mL，充分溶解，定容至100ml室温保存。2.RIPA裂解液1ml裂解液工作液配方：10ul100mmol/LPMSF(1mM)0.2ul10mg/mlAprotinin(2ug/ml)5.0ul1mg/mlLeupeptin(5ug/ml)0.9848ml裂解液0.5ml裂解液工作液配方：5ul100mmol/LPMSF(1mM)0.1ul10mg/mlAprotinin(2ug/ml)2.5ul1mg/mlLeupeptin(5ug/ml)0.4924ml裂解液PMSF必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/LPMSF：17.4mgPMSF粉末溶于1ml异丙醇(AR)，分装250ul每管后－20℃保存。使用终浓度为1mmol/L。【PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。PMSF剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。】二．蛋白定量试剂：1.BCA蛋白定量试剂盒2.10ml0.9%的生理盐水（90mgNaCl溶于10ml去离子水中）三．上样用试剂：6×SDS上样缓冲液：取一个离心管，秤取2.0gSDS粉末，6mg溴酚蓝(BromopHenolblue;Albutest)粉末，然后用枪头加入5mL1.5mol/LTris-HCl(pH6.8)，用移液管加入10mLGlycerol(甘油，丙三醇)，枪头加入2mLβ-mercapteethanol（β-巯基乙醇）充分混匀，加双蒸水定容至20ml，涡旋溶解。4℃避光保存。试剂盒RIPA四．电泳工作液：1.1.5mol/LTris-HCl缓冲液：（三（羟甲基）氨基甲烷）称取18.171gTris粉末，加入60mL双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。2.1.0mol/LTris-HCl缓冲液：称取12.114gTris粉末，加入60mL双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。3.0.5mol/LTris-HCl缓冲液：称取6.057gTris粉末，加入60mL双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。4.10%APS：(一周内使用，最好新鲜配置)称取0.5gAPS粉末，加入双蒸水至5mL，充分溶解，4℃保存。5.10%SDS:秤取10gSDS粉末溶于100ml双蒸水中，可50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用5.分离胶（下层胶）：分离胶5%7.5%10%12%15%30%acrylamide/bis1.68ml2.5ml3.35ml4.02ml5ml1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml10%SDS100ul100ul100ul100ul100ulDdH2O5.474.65ml3.8ml3.13ml2.15ml10%APS（灌胶时再加）50μL50μL50μL50μL50μLTEMED（灌胶时再加）5ul5ul5ul5ul5ul分离蛋白分子量57-212KD36-94KD20-80KD12-60KD10-43KD混匀后在室温下静置15min，然后加入5ulTEMED即为分离胶，即可灌胶。6.4%浓缩胶（上层胶）：0.7mL30%Acr/Bis；1.5mL0.5mol/LTris-HCl(pH6.8)；60μL10%SDS；3.6mL双蒸水混匀后加入50μL10%APS和5μLTEMED（灌胶时再加）。7.1×电泳液缓冲液（使用液）（PH=8.3）：3.04gTris粉末，14.4g甘氨酸（Glycine）粉末，1gSDS粉末溶于800ml双蒸水中，调PH=8.3，用ddH2O定容至1000ml，室温保存。可重复使用3-5次。10×电泳液缓冲液（储存液）（PH=8.3）：30.4gTris粉末，144g甘氨酸（Glycine）粉末，10gSDS粉末溶于800ml双蒸水中，调PH=8.3（浓HCl调），用ddH2O定容至1000ml，室温保存。五．转膜工作液：1×转膜液缓冲液（使用液）（PH=8.3）：3.0gTris粉末，14.1g甘氨酸（Glycine）粉末，1.25gSDS粉末溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml，溶解后室温保存，使用时再加250mL甲醇(AR)可重复使用3-5次。10×转膜液缓冲液（储存液）（PH=8.3）：30.0gTris粉末，141g甘氨酸（Glycine）粉末，12.5gSDS粉末溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml，溶解后室温保存。使用时稀释10倍，加入20%甲醇。可取10×溶液100ml,ddH2O900ml，甲醇250ml。（重复利用再重新加入甲醇50ml）六．封闭液1g脱脂奶粉于20mL1XTBST混匀,4℃保存。保存时间不能太久，有味道就不能用了。七．抗体孵育用液1XTBST缓冲液（使用液）：24.2gTris粉末，87.6gNaCl，10mLTween20（AR)溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml调节pH至7.4。室温保存。10XTBST缓冲液（储存液）：24.2gTris粉末，87.6gNaCl，10mLTween20（AR)溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml调节pH至7.4。室温保存。八．丽春红染液（可回收利用）九．显影液WesternLightningECLPro十．STRIP膜再生试剂100ml5ml8ml12ml14ml10%SDS20ml1ml1.6ml2.4ml2.8ml0.5MTrisHCl（pH6.8）12.5ml0.625ml1ml1.5ml1.75mlddH2067.5ml3.375ml5.4ml8.1ml9.45mlβ-mercaptoethanol0.8ml40ul64ul96ul112ul操作步骤：（一）蛋白样品制备（1）待测蛋白细胞收集1.准备冰盒，提前准备好需要的试剂和器材，EP管：标记好相关信息（细胞名称，蛋白提取，转染信息，时间）；离心管，滴管，含血清的培养液，胰蛋白酶，PBS。4℃离心机提前预冷；2.弃掉皿内的无血清培养液（含血清的培养液，可直接收到相应的离心管），用1.0ml的PBS清洗，将PBS收到相应的离心管内，再用1.0ml的PBS清洗，收集PBS，每皿加1ml的胰蛋白酶进行消化，37℃，5min。3.消化后将皿放在冰盒上，冰上操作。用培养液（可以用离心管内带血清的培养液）吹打细胞，收入离心管（可再冲洗一次，冲洗干净），将离心管配平后放1500r/5min离心。4.取出离心管，吸掉上清（注意不要碰到蛋白固体），管底留少量液体，用手弹离心管底部，震荡离心管，加入1ml的PBS吹打几次后移入相应的EP管，在离心管再加入0.5ml的PBS清洗加入EP管。EP管配平后4℃，1500r/5min。5.取出EP管，轻轻吸掉上清，留少许液体在底部，弹几下EP管进行震荡，加入1.5ml的PBS涡旋3-5次，配平后4℃，1500r/5min。6.取出EP管，轻轻吸掉上清，留少许液体在底部，配平状态在4℃离心机进行离心，转速为最高转速14800转，达到此速度立刻停止，取出EP管，小心吸掉所有的液体。7.将EP管放在-80℃冰箱内保存。（2）细胞总蛋白的提取：1.准备相应的试剂和器材，按照配方配置裂解液和PMSF溶液，4℃离心机提前开机预冷，准备冰盒。2.取出收集好的蛋白样品置于冰上。3．按照配方配置裂解工作液，（根据试剂盒实际要求）摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合），取40-50ul（细胞多用50ul）裂解工作液加入细胞EP管中，吹打均匀，涡旋几次，冰上裂解30min,（裂解期间每10min涡旋一次），裂解完成后再涡旋一次然后转移至4℃离心机14800r/20min（提前开离心机预冷）。取出离心后的EP管吸取上清，置于新的EP管中。4.将轻微离心后的上清可分装后放于－20℃保存。（二）蛋白含量的测定1.配置10ml0.9%的生理盐水（90mgNaCl溶于10ml去离子水中），用于配置相应的BSA梯度溶液。2.将标准样品和蛋白样品按下表稀释和加样检测范围=(20-2000ug/ml)瓶号ABCDEFGH样品BSA含量0ug1ug2.5ug5ug10ug20ug40ug50ug2mg/mlBSA-0.5ul1.25ul2.5ul5ul10ul20ul25ul1ul0.9%saline25ul24.5ul23.75ul22.5ul20ul15ul5ul-24ul工作液200ul200ul200ul200ul200ul200ul200ul200ul200ulBSA终浓度(ug/ml)04010020040080016002000工作液最后加，加工作业速度要快，且在冰上操作。样品：工作液=1：8（25ul:200ul）3.BCAA:BCAB=50:1,每孔需要200ul工作液。根据需要的数量配置工作液，所需工作液的总体积为：(标准品的个数+待测蛋白质样品的个数)×(实验重复次数)×(用于每个样品的工作液的体积)=所需的工作液（当试剂B加入到试剂A中时，开始可观察到有浑浊产生，经搅拌后浑浊会迅速消失，得到绿色澄清工作液。工作液储存于密闭容器中，在室温下可稳定保存数天）注：如果样品有限，则可取标准品和待测未知样品10ul（样品与工作液的比例为1:20）。然而，在这种情况下，定量分析的检测范围将被限制在125-2000g/mL。ABCDEFGHI4.将微孔板密封，在37℃恒温箱30转中孵育30分钟。（孵育时盖报纸避光）5.将微孔板冷却到室温。使用微孔板读数仪，测量样品在562nm或该波长附近的吸光值。打开酶标仪“Gen5CHS2.04”图标→新建记录→检测，吸收光→波长562→打开96孔板盖子放入机器开始检测，将结果复制到Excel中拷贝。该方法在波长540-590nm范围内均可成功得到结果。由于微孔板酶标仪的光路长度比使用比色皿的分光光度计短，因此微孔板方案要求样品与工作液的比例更高，才能获得与试管标准方案相同的灵敏度。如果想要得到较高的562nm处的吸光值，则需将孵育时间增加到2小时。延长孵育时间或升高温度将会增加样品在562nm处的吸光值，也会降低试剂的最低检测下限和该方案的检测范围。6.将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值根据公式计算出相应的蛋白浓度。2016/3/9全蛋白No.SamplenameODOD0OD－OD0Testvolume(μl)proteinconcentration(μg/μl)Samplevolume(μl)protein(μg)Addingsamplevolume(μl/20μg蛋白)Sample1A549-Ctrl-20.6950.3470.34816.9040499.072.90标准蛋白样品待测蛋白4hSample2A549-NTsiRNA-24h0.63