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WesternBlotWesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄(NC)膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。流程:蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。实验器材和试剂:一.蛋白提取试剂1.10%SDS裂解液:称取10gSDS粉末加入双蒸水至90mL,充分溶解,定容至100ml室温保存。2.RIPA裂解液1ml裂解液工作液配方:10ul100mmol/LPMSF(1mM)0.2ul10mg/mlAprotinin(2ug/ml)5.0ul1mg/mlLeupeptin(5ug/ml)0.9848ml裂解液0.5ml裂解液工作液配方:5ul100mmol/LPMSF(1mM)0.1ul10mg/mlAprotinin(2ug/ml)2.5ul1mg/mlLeupeptin(5ug/ml)0.4924ml裂解液PMSF必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3.蛋白酶抑制剂:100mmol/LPMSF:17.4mgPMSF粉末溶于1ml异丙醇(AR),分装250ul每管后-20℃保存。使用终浓度为1mmol/L。【PMSF:在溶液中不稳定,应在临用前从储存液中现加于裂解液中。PMSF剧毒,严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤,吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。】二.蛋白定量试剂:1.BCA蛋白定量试剂盒2.10ml0.9%的生理盐水(90mgNaCl溶于10ml去离子水中)三.上样用试剂:6×SDS上样缓冲液:取一个离心管,秤取2.0gSDS粉末,6mg溴酚蓝(BromopHenolblue;Albutest)粉末,然后用枪头加入5mL1.5mol/LTris-HCl(pH6.8),用移液管加入10mLGlycerol(甘油,丙三醇),枪头加入2mLβ-mercapteethanol(β-巯基乙醇)充分混匀,加双蒸水定容至20ml,涡旋溶解。4℃避光保存。试剂盒RIPA四.电泳工作液:1.1.5mol/LTris-HCl缓冲液:(三(羟甲基)氨基甲烷)称取18.171gTris粉末,加入60mL双蒸水中,加盐酸调节pH至6.8或8.8,定容至100mL。4℃保存。可致癌,不要直接接触皮肤。2.1.0mol/LTris-HCl缓冲液:称取12.114gTris粉末,加入60mL双蒸水中,加盐酸调节pH至6.8或8.8,定容至100mL。4℃保存。可致癌,不要直接接触皮肤。3.0.5mol/LTris-HCl缓冲液:称取6.057gTris粉末,加入60mL双蒸水中,加盐酸调节pH至6.8或8.8,定容至100mL。4℃保存。可致癌,不要直接接触皮肤。4.10%APS:(一周内使用,最好新鲜配置)称取0.5gAPS粉末,加入双蒸水至5mL,充分溶解,4℃保存。5.10%SDS:秤取10gSDS粉末溶于100ml双蒸水中,可50℃水浴下溶解,室温保存。如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后,仍可使用5.分离胶(下层胶):分离胶5%7.5%10%12%15%30%acrylamide/bis1.68ml2.5ml3.35ml4.02ml5ml1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml10%SDS100ul100ul100ul100ul100ulDdH2O5.474.65ml3.8ml3.13ml2.15ml10%APS(灌胶时再加)50μL50μL50μL50μL50μLTEMED(灌胶时再加)5ul5ul5ul5ul5ul分离蛋白分子量57-212KD36-94KD20-80KD12-60KD10-43KD混匀后在室温下静置15min,然后加入5ulTEMED即为分离胶,即可灌胶。6.4%浓缩胶(上层胶):0.7mL30%Acr/Bis;1.5mL0.5mol/LTris-HCl(pH6.8);60μL10%SDS;3.6mL双蒸水混匀后加入50μL10%APS和5μLTEMED(灌胶时再加)。7.1×电泳液缓冲液(使用液)(PH=8.3):3.04gTris粉末,14.4g甘氨酸(Glycine)粉末,1gSDS粉末溶于800ml双蒸水中,调PH=8.3,用ddH2O定容至1000ml,室温保存。可重复使用3-5次。10×电泳液缓冲液(储存液)(PH=8.3):30.4gTris粉末,144g甘氨酸(Glycine)粉末,10gSDS粉末溶于800ml双蒸水中,调PH=8.3(浓HCl调),用ddH2O定容至1000ml,室温保存。五.转膜工作液:1×转膜液缓冲液(使用液)(PH=8.3):3.0gTris粉末,14.1g甘氨酸(Glycine)粉末,1.25gSDS粉末溶于800ml双蒸水中,用ddH2O定容至1000ml,溶解后室温保存,使用时再加250mL甲醇(AR)可重复使用3-5次。10×转膜液缓冲液(储存液)(PH=8.3):30.0gTris粉末,141g甘氨酸(Glycine)粉末,12.5gSDS粉末溶于800ml双蒸水中,用ddH2O定容至1000ml,溶解后室温保存。使用时稀释10倍,加入20%甲醇。可取10×溶液100ml,ddH2O900ml,甲醇250ml。(重复利用再重新加入甲醇50ml)六.封闭液1g脱脂奶粉于20mL1XTBST混匀,4℃保存。保存时间不能太久,有味道就不能用了。七.抗体孵育用液1XTBST缓冲液(使用液):24.2gTris粉末,87.6gNaCl,10mLTween20(AR)溶于800ml双蒸水中,用ddH2O定容至1000ml调节pH至7.4。室温保存。10XTBST缓冲液(储存液):24.2gTris粉末,87.6gNaCl,10mLTween20(AR)溶于800ml双蒸水中,用ddH2O定容至1000ml调节pH至7.4。室温保存。八.丽春红染液(可回收利用)九.显影液WesternLightningECLPro十.STRIP膜再生试剂100ml5ml8ml12ml14ml10%SDS20ml1ml1.6ml2.4ml2.8ml0.5MTrisHCl(pH6.8)12.5ml0.625ml1ml1.5ml1.75mlddH2067.5ml3.375ml5.4ml8.1ml9.45mlβ-mercaptoethanol0.8ml40ul64ul96ul112ul操作步骤:(一)蛋白样品制备(1)待测蛋白细胞收集1.准备冰盒,提前准备好需要的试剂和器材,EP管:标记好相关信息(细胞名称,蛋白提取,转染信息,时间);离心管,滴管,含血清的培养液,胰蛋白酶,PBS。4℃离心机提前预冷;2.弃掉皿内的无血清培养液(含血清的培养液,可直接收到相应的离心管),用1.0ml的PBS清洗,将PBS收到相应的离心管内,再用1.0ml的PBS清洗,收集PBS,每皿加1ml的胰蛋白酶进行消化,37℃,5min。3.消化后将皿放在冰盒上,冰上操作。用培养液(可以用离心管内带血清的培养液)吹打细胞,收入离心管(可再冲洗一次,冲洗干净),将离心管配平后放1500r/5min离心。4.取出离心管,吸掉上清(注意不要碰到蛋白固体),管底留少量液体,用手弹离心管底部,震荡离心管,加入1ml的PBS吹打几次后移入相应的EP管,在离心管再加入0.5ml的PBS清洗加入EP管。EP管配平后4℃,1500r/5min。5.取出EP管,轻轻吸掉上清,留少许液体在底部,弹几下EP管进行震荡,加入1.5ml的PBS涡旋3-5次,配平后4℃,1500r/5min。6.取出EP管,轻轻吸掉上清,留少许液体在底部,配平状态在4℃离心机进行离心,转速为最高转速14800转,达到此速度立刻停止,取出EP管,小心吸掉所有的液体。7.将EP管放在-80℃冰箱内保存。(2)细胞总蛋白的提取:1.准备相应的试剂和器材,按照配方配置裂解液和PMSF溶液,4℃离心机提前开机预冷,准备冰盒。2.取出收集好的蛋白样品置于冰上。3.按照配方配置裂解工作液,(根据试剂盒实际要求)摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合),取40-50ul(细胞多用50ul)裂解工作液加入细胞EP管中,吹打均匀,涡旋几次,冰上裂解30min,(裂解期间每10min涡旋一次),裂解完成后再涡旋一次然后转移至4℃离心机14800r/20min(提前开离心机预冷)。取出离心后的EP管吸取上清,置于新的EP管中。4.将轻微离心后的上清可分装后放于-20℃保存。(二)蛋白含量的测定1.配置10ml0.9%的生理盐水(90mgNaCl溶于10ml去离子水中),用于配置相应的BSA梯度溶液。2.将标准样品和蛋白样品按下表稀释和加样检测范围=(20-2000ug/ml)瓶号ABCDEFGH样品BSA含量0ug1ug2.5ug5ug10ug20ug40ug50ug2mg/mlBSA-0.5ul1.25ul2.5ul5ul10ul20ul25ul1ul0.9%saline25ul24.5ul23.75ul22.5ul20ul15ul5ul-24ul工作液200ul200ul200ul200ul200ul200ul200ul200ul200ulBSA终浓度(ug/ml)04010020040080016002000工作液最后加,加工作业速度要快,且在冰上操作。样品:工作液=1:8(25ul:200ul)3.BCAA:BCAB=50:1,每孔需要200ul工作液。根据需要的数量配置工作液,所需工作液的总体积为:(标准品的个数+待测蛋白质样品的个数)×(实验重复次数)×(用于每个样品的工作液的体积)=所需的工作液(当试剂B加入到试剂A中时,开始可观察到有浑浊产生,经搅拌后浑浊会迅速消失,得到绿色澄清工作液。工作液储存于密闭容器中,在室温下可稳定保存数天)注:如果样品有限,则可取标准品和待测未知样品10ul(样品与工作液的比例为1:20)。然而,在这种情况下,定量分析的检测范围将被限制在125-2000g/mL。ABCDEFGHI4.将微孔板密封,在37℃恒温箱30转中孵育30分钟。(孵育时盖报纸避光)5.将微孔板冷却到室温。使用微孔板读数仪,测量样品在562nm或该波长附近的吸光值。打开酶标仪“Gen5CHS2.04”图标→新建记录→检测,吸收光→波长562→打开96孔板盖子放入机器开始检测,将结果复制到Excel中拷贝。该方法在波长540-590nm范围内均可成功得到结果。由于微孔板酶标仪的光路长度比使用比色皿的分光光度计短,因此微孔板方案要求样品与工作液的比例更高,才能获得与试管标准方案相同的灵敏度。如果想要得到较高的562nm处的吸光值,则需将孵育时间增加到2小时。延长孵育时间或升高温度将会增加样品在562nm处的吸光值,也会降低试剂的最低检测下限和该方案的检测范围。6.将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值根据公式计算出相应的蛋白浓度。2016/3/9全蛋白No.SamplenameODOD0OD-OD0Testvolume(μl)proteinconcentration(μg/μl)Samplevolume(μl)protein(μg)Addingsamplevolume(μl/20μg蛋白)Sample1A549-Ctrl-20.6950.3470.34816.9040499.072.90标准蛋白样品待测蛋白4hSample2A549-NTsiRNA-24h0.63
本文标题:Western-blot详细操作过程
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