先导物选择与优化

先导物选择与优化系统策略和方法前言在新药研究过程中，先导化合物的早期发现和优化是关键一步。传统工作模式:设计合成新化合物，提高其体外或体内的药理活性强度和选择性，以此为标准挑选出候选药进入临床前研究。虽然药物化学家明白药物理化性质的重要，但通常仅作为影响药理活性的因素之一考虑。结果:进一步开发上市的成功率常常很低。原因：毒性，临床疗效和生物药剂学性质等。候选药物的毒性、临床疗效不好和生物药剂学性质差是开发失败或进展缓慢的主要原因失败原因及比例进展缓慢原因药动学性质不良，39%临床疗效差，29%毒性反应，21%市场原因，6%化学等其他因素，5%合成工艺复杂发现可疑毒性生物药剂学性质差活性低靶标先天不足20世纪90年代以来新化合物数量聚增(初筛数据)（基因组学、计算机辅助药物设计、组合化学）20世纪90年代初期20万/年20世纪90年中代期500—600万/年20世纪90年代末期5000万/年2005年约1亿/年1991年～2000年平均上市新药约35个/年2003年仅7个，2005年~40个“低产”的主要原因：a.新靶标的可靠性；b.先导化合物选择和优化产生的侯选药物的内在质量。为提高新药开发的成功率，选择先导化合物和侯选药物时，除体外和体内药效学指标外，需要增加早期评价指标，包括生物药剂学、药动学、毒理学参数，并综合多学科的试验结果。1.药物生物利用度相关理化性质的早期预测影响药物进入生物相的因素：给药途径和剂型，药物的崩解速率、溶解度、对生物膜的通透性、在体液和组织中的分布，生物转化的类型、数量和速率，重吸收和清除等。药物遗传学因素和某些病理因素。口服（最常用的给药途径）——生物利用度是生物药剂学和药代动力学共同相关的性质药物化学家考虑较多的是溶解度、油水分配常数、膜通透性等与分子结构相关的理化性质。1).溶解度(1).溶解度的快速测量—浊度法优点：快速和便于自动化。但结果不如经典的平衡测量法精确。具体操作：将待测样品溶于DMSO中，配制成10g/L的样品溶液，取2.5mL无氯离子的磷酸盐缓冲液(pH7)置UV吸收池内。室温下向吸收池加入1L样品DMSO液，间隔1min再第2次加入，加样总次数为17，相当于每次溶解度增量＜5g/mL，最后一次加入终浓度＞65g/mL。如果在加入早期明显出现沉淀，马上停止加入，以便有二个明显读数。用二极管阵列UV检测器测定沉淀物的光散射强度。为了避免药物的吸收UV区，一般采用的检测波长范围为600～820nm。沉淀点用双线性拟合吸收值(y轴)对DMSOL数(x轴)，二条S形曲线的交叉点坐标x为沉淀析出时的DMSOL数，y为沉淀光吸收值，已知样品DMSO溶液的溶解度和吸收池内缓冲液体积，即可计算出沉淀点每mL缓冲液中药物样品的量(g)，计算出溶解度。晶体堆积能、空化能和溶解能的函数。尚无准确可靠的计算化学方法预测溶解度。文献中结合训练系列化合物的具体性质提出了几种回归方程。改良的溶解能测定法，可从实验数据或分子结构预测化合物的水溶解度（logSw）具体方法：收集多种结构类型的664个化合物，删除其中偏差太大的5个化合物（含2个二元羧酸）。对其中594个化合物建立回归方程：(2).水溶解度的计算法logSw=0.518−1.044R2+0.771π2H+2.681∑α2H+4.238∑β2H−3.362∑α2H∑β2H−3.987Vxn=594,SD=0.557,r2=0.920,F=1256R2剩余摩尔折射率（cm3•mol-1/10）π2H偶极矩/极化度∑α2H氢键酸度总和∑β2H氢键碱度总和∑α2H∑β2H分子中酸性基团碱性基团之间的氢键相互作用VxMcGowan特征体积（cm3•mol-1/100）n样本数SD标准偏差r2相关系数F方差用上述方程计算剩余的65个化合物的水溶解度（logSw），对比实验测定值，SD=0.56。相关方程表明：•一个化合物的氢键能力有助于提高水溶性•增加分子的偶极矩或极化度能提高水溶性•增加分子的剩余摩尔折射率或体积降低水溶性油水分配系数对药物的被动转运有最直接的意义；另外，它与蛋白结合、清除等药动学参数也有密切关系。在QSAR研究过程中，曾经对油水分配系数进行过多种研究。有两个方面的进展最值得注意：a.提出了从头计算油水分配系数的软件ClogP，它有较强的预测能力；b.提高实验测量油水分配系数方法的简便性、通量和预测能力2).油水分配系数和细胞通透性例如最近开发的自动电位滴定技术，可用于先导物的选择和药物开发。测定了21种结构不同且可离子化的常用药物在pH6.8脂质体系统中的分配，这些药物的人体口服吸收范围从小于5％到几乎100％。发现药物在人体的小肠被动吸收与根据脂质体分配系数和溶解度-剂量比例计算出的吸收力参数之间有S形曲线关系，而与正辛醇作为分配相计算出来的吸收力或油水分配系数logP相关性差。有一种固定化人工膜系将纯化的细胞膜键合在硅胶载体上构成细胞膜脂质环境的色谱模型，国外己有商品上市，如美国Regis化学品公司的IAM.PC.DD快速简便的测量方法，其特点是具有设计好的磷脂胆碱表面，所反映的油水分配过程体现了亲脂性和静电力两种相互作用。因此有实验评价IAM容量因子（K′IAM）比较适合于作为药物小肠吸收模型。缺点：采用HPLC分析测量，使分析样品的通量受到限制Kansy等报道了一种适合于高通量筛选要求的人工膜平行测量细胞膜通透性的方法：用96孔微量滴定板，孔内全部注满pH7.4或pH6.5的缓冲液，盖上滤板，滤板为夹层结构，内置孔径为0.22～0.45m的疏水性滤材。前一半48孔为样品管，注满卵磷脂有机溶液(癸烷、己烷等)；另一半48孔为对照，滤器表面用4～5L体积分数为50%的甲醇缓冲液润湿。分别在样品孔和对照孔滤板顶上加入100～200L205～500mol/L待测化合物贮存液。贮存液中DMSO最高浓度为5%；缓冲液常0.05mol/L磷酸盐pH6.5缓冲液。用96孔微板紫外光度计同时用6个不同波长测量样品的通透性，以对照液为内标。测定样品通透性所得的移动值用已知的人体吸收数据校正。优点：一天可测几百个样品通透性，亦易测出pH变化、磷脂组成、溶解度、表面活性剂对通透过程的影响。3).口服生物利用度(1).利宾斯基定性规则辉瑞公司的新药研究工作者早就认识到药物理化性质对新药开发成功率的重要价值。他们研究了世界药物索引库50427个化合物及USAN中收载的7894个药物的溶解度和细胞通透性，总结出一个简单的定性规则：小肠吸收差的药物分子一般具有下述4条特征中的任意2条：（1）相对分子质量大于500；（2）氢键供体数目大于5；（3）氢键受体数目大于10；（4）logP计算值5。粗略的定性规则，但却有很实际的指导意义。(2).口服生物利用度的计算方法Johnson等认为，细胞通透性和药物在胃肠道的溶解度是决定小肠吸收率的两个主要因素。他们提出用于计算药物在人体小肠内的吸收剂量（EDA）的方程式。EDA（ms）＝Ka·V·Cs·tres式中，Ka＝2Peff-h／r，为吸收速率常数；CS为溶解度；V为胃肠道体积；tres为药物停留时间；Peff-h为实际人体细胞通透性；r为人体小肠半径。通常V=25OmL，tres=4h，r=2cm。对于高度水溶性的化合物，用剂量／体积比代替CS即可算出EDA。对于水溶性中等或较差的化合物，则用实际溶解度数值Cs代入方程式计算EDA。在新药早期发现阶段，EDA可以提供一种实用的启迪，用于排列各种化合物或结构类别的吸收顺序。如果待开发的候选药设计剂量大于EDA，等于告诉研究者应当思考：通过分子修饰提高药物在胃肠道溶解度的可能性；通过改变处方增加药物溶解度或溶出度的可能性。Andrews等提出了一种结构－生物利用度定量关系（QSBR）模型，用以预测药物的人体口服生物利用度基本思路与方法类似于QSAR。已经开发出几种分析软件。该作者从文献中选取了591种药物，都有相应的口服生物利用度实验数据，并进行结构分类，列出608种亚结构“指纹”，标以特定的计算机描述符。用SAS统计分析软件进行处理，建立QSBR回归方程，包含了85种亚结构描述符。该方程可以根据化合物结构预测其人体生物利用度：方程的传统回归系数R2为0.71，预测误差为18％，已知实验平均误差为12％，表明回归方程的误差尚算合理。模型交叉验证R2为0.63，显示模型有较好的预测能力。如果参考Toppliss工作树，设置二级结构参数，可以减少结构描述符的相互作用，提高预测精度。有人将QSBR模型与利宾斯基定性规则作了比较，表明QSBR模型预测准确性较高，可以减少假阳性结果。有人通过系统分析提出了一些影响生物利用度的结构启示：较小分子比大分子生物利用度高；每增加1个比氢原子重的原子，大约降低生物利用度1%；H键供体描述符为负系数，降低生物利用度，降低作用较大的结构片断如四氮唑、4-氨基吡啶、苯醌、二氢呋喃、环己酮等；H键受体描述符为正系数，增加生物利用度，增加作用较大的结构片断如叠氮化合物、1-甲基环戊醇、水杨酸、氰胍等。N-末端氨基酸残基、内部氨基酸残基为负效应，芳香烃基酮比芳酸烃基酯的生物利用度差。(3).口服生物利用度的实验模型有多种实验模型：如细胞匀浆、单层细胞、离体肠管、小肠灌流、转基因细胞系等。最常用：单层细胞和大鼠小肠灌流技术。2.药代动力学性质的早期预测1).药物开发中关键的药动学参数药动学是药物开发中决定药物治疗价值和用法的有力依据。成功的药物开发程序所要考察的关键药动学参数：清除率、治疗窗浓度、以原型排出的药物百分数（fu）、血液/血浆浓度比、半衰期、毒性浓度、分布容积、蛋白结合率（p）、吸收率这些药动学参数的关系如下：FD/τ=CssCLCL=0.693Vd/t1/2Vd=Vp+（Vtfup/fut）F为生物利用度；D为剂量；τ为用药时间间隔；Css为血浆中稳态药物浓度；CL为总清除率；Vd为分布容积；t1/2为清除半衰期；Vp为血浆体积；Vt为组织体积；fup和fut分别为血浆和组织中未结合药物的百分数。一个药物能否以口服剂型上市，fu和Css是主要判断依据。fu接近0的药物不适于口服，在分子修饰时引入极性基团或去掉药效团以外的非极性基团，可降低这类分子的亲脂性，使其较适合口服。通常希望半衰期长些。亲脂性是表征分布性质的一个很好的指标。亲脂性可经下式估算：Vd=(0.0955P＋1.2232)(1－p)BW(mL)P为分配系数；p为蛋白结合率；BW为体重（以g计）。药物的亲脂性越高，Vd值就越高。碱性药物在生理条件下易离子化，其荷正电的碱性中心与生物膜上荷负电的磷酸头相互作用，使Vd值升高。药物在脑内的分布也大致如此，但亲脂性特别高的药物反而不易通过血脑屏障，可能与脑毛细血管上皮细胞顶端的p-糖蛋白的阻碍有关。2).药物代谢特征的快速预测(1).代谢稳定性体外筛选肝微粒体比肝切片、肝细胞培养基、肝灌流都简便易得。它可以来源于任何动物，也包括人；可以提供简单的或较复杂的代谢参数，甚至可能推测人体代谢特征，容易采用自动化测量系统，因此它是最适合于新药早期发现阶段高通量筛选代谢稳定性的一线工具。如果化合物属第Ⅰ相代谢清除，那么用肝微粒体培养的实验结果类似于活性肝代谢。但应当注意，在体外培养实验条件的影响，如药物浓度。在初筛过程中肝微粒体系统中有许多代谢酶容易处于药物高度饱和状态，结果根据单个底物浓度计算出的代谢速率也许大大低于体内实验结果。当注意选择合适浓度时，肝微粒体系统完全适用于高通量筛选。肝微粒体不含第Ⅱ相代谢酶。涉及第1相第Ⅱ相代谢酶的药物筛选应采用肝细胞模型。Bertrand等提出了一种根据计算机拟合药物体外消除曲线用Michaelis-Menten整合方程测定药物全程代谢表观Km和Vm的简单方法。该法以两种浓度药物（如10-7mol/L，10-8m