水溶性羧酸咔咯铁(Ⅲ)配合物对DNA的氧化断裂作用

Vol.34高等学校化学学报No.112013年11月摇摇摇摇摇摇CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES摇摇摇摇摇摇2462~2469摇摇doi:10.7503/cjcu20130610水溶性羧酸咔咯铁(芋)配合物对DNA的氧化断裂作用张摇阳1,陈摇欢1,闻金燕1,王湘利1,王摇惠2,计亮年2,3,刘海洋1,2(1.华南理工大学化学系,广州510641;2.中山大学光电材料与技术国家重点实验室,3.生物无机与合成化学教育部重点实验室,广州510275)摘要摇合成了5,10,15鄄三(4鄄羧基鄄苯基)咔咯铁配合物(Fe芋TCPC),采用紫外鄄可见光谱、荧光光谱、圆二色光谱和黏度法研究了Fe芋TCPC与小牛胸腺DNA(ct鄄DNA)的相互作用,并用琼脂糖凝胶电泳研究了氧化剂参与下Fe芋TCPC对pBR22DNA的氧化断裂能力.结果表明,Fe芋TCPC与DNA的作用方式为外部结合模式,其结合常数Kb=1郾96伊105L/mol.在过氧化氢(H2O2)或叔丁基过氧化氢(TBHP)为氧化剂条件下,Fe芋TCPC展现出良好的DNA氧化断裂能力,且TBHP的氧化断裂效率比H2O2好.用H2O2和TBHP为氧化剂时,Fe芋TCPC可能是通过活性Fe吁鄄oxo机制对DNA氧化断裂.关键词摇咔咯;铁;DNA;氧化断裂中图分类号摇O614郾81摇摇摇摇文献标志码摇A收稿日期:2013鄄07鄄02.基金项目:国家自然科学基金(批准号:21171057,21171177)、广东省自然科学基金(批准号:10351064101000000,9351027501000003)和中山大学光电材料与技术国家重点实验室开放基金(批准号:2012鄄KF鄄MS2)资助.联系人简介:刘海洋,男,博士,教授,主要从事大环化合物和化学生物学研究.E鄄mail:[e-mail]过渡金属配合物模拟核酸酶断裂DNA的研究一直是生物无机化学领域的重要课题,相关研究对于拓展配合物在抗癌药物方面的应用具有重要意义[1~5].卟啉大环化合物与DNA的相互作用研究已取得了重要进展[6,7],部分金属卟啉配合物已被用于临床诊断和治疗[8,9].水溶性是合成药物的重要特性,目前已合成了许多水溶性卟啉,如吡啶基阳离子型卟啉[10]、磺酸卟啉[11]和羧酸卟啉[12].这些水溶性卟啉在人工核酸酶[13]、光动力治疗[14]和DNA探针[15]方面具有潜在的应用前景.咔咯是一种与卟啉有相似结构的大环化合物,因其具有相对于卟啉更小的内腔而表现出更好的稳定高价金属离子的能力,已成为现代卟啉化学的新研究亮点[16].咔咯金属配合物在催化、生物无机化学、光物理化学等方面的研究已引起了人们的广泛兴趣[17].水溶性磺化咔咯和阳离子型咔咯的合成开拓了咔咯在生物无Fig.1摇Structureofiron(芋)5,10,15鄄(4鄄carboxyl鄄phenyl)corrole(Fe芋TCPC)机化学领域的应用[18].研究表明,磺化咔咯及其金属配合物能与人血清蛋白紧密结合[19],其中铁和锰配合物结合之后能形成一种简单高效的仿生系统[20];磺化镓配合物和磺化锰配合物分别表现出光断裂或氧化断裂DNA的能力[21,22].带有2个阳离子的吡啶基咔咯5,15鄄二(N鄄甲基鄄吡啶基)鄄10鄄(五氟苯基)咔咯锰的配合物能够与DNA紧密结合,其结合能力比结构相似的卟啉更强,此外这种物质还拥有很好的生物和催化活性[23];5,10,15鄄三(N鄄甲基鄄吡啶基)咔咯锰的配合物能选择性地与非双链DNA环形及凸起部位的鸟嘌呤相互靠近,进而在过硫酸氢钾的存在下通过氧原子转移的方式导致DNA的特定断裂[24],此配合物还展现出良好的核酸酶活性[25];周翔等[26,27]合成了一系列阳离子型咔咯,发现这些阳离子型咔咯不仅能很好地稳定DNAG鄄四链体结构,还能抑制DNA拓扑异构酶[28]和乙酰胆碱酯酶[29]的活性,在抗癌药物领域展现出巨大的应用前景.羧基咔咯也是一类水溶性咔咯[30~32],但这类咔咯与DNA相互作用的研究尚未引起人们的关注.水溶性铁卟啉具有很好的氧化断裂DNA能力[33],为探讨水溶性铁咔咯配合物与DNA的作用,本文合成了5,10,15鄄三(4鄄羧基苯基)咔咯铁配合物(Fe芋TCPC,图1),对其与DNA的结合性质及在不同氧化剂的条件下对DNA的催化氧化断裂作用进行了研究.1摇实验部分1.1摇试剂与仪器小牛胸腺DNA(ct鄄DNA)购于Sigma公司;pBR322DNA购于大连宝生物工程有限公司;琼脂糖、溴化乙锭(EB)、三羟甲基甲胺(Tris)、氯化钠(NaCl)、硼酸(H3BO3)和乙二胺四乙酸(EDTA)均购自上海生工生物工程公司且均为高纯度生物试剂;盐酸和其它试剂均为分析纯.实验用水为二次蒸馏水.3900H型紫外鄄可见光谱仪(日本日立公司);F鄄4500型荧光分光光度计(日本日立公司);J鄄810型圆二色光谱仪(日本分光公司);31鄄CN型凝胶电泳仪(北京六一仪器厂);BIO鄄RADGelDoxXR+凝胶自动成像分析系统(美国伯乐公司).1.2摇样品的制备1.2.1摇5,10,15鄄三(4鄄甲氧基羰基鄄苯基)咔咯的合成摇将4鄄(甲氧基羰基)苯甲醛(820mg,5mmol)和吡咯(670mg,10mmol)加入200mL甲醇/水(体积比1颐1)混合溶液中,再加入HCl(0郾25mmol)溶液,室温下搅拌反应3h;反应结束后用二氯甲烷萃取,收集有机相并水洗3次,用Na2SO4干燥后过滤,加入2,3鄄二氯鄄5,6鄄二氰基鄄1,4鄄苯醌(DDQ,1g)反应1h.粗产物以硅胶为固定相、二氯甲烷/乙腈(体积比100颐5)为流动相进行纯化,得到绿色产物,产率19%.UV鄄Vis(CH2Cl2),姿max/nm:420,581,617,647;1HNMR(400MHz,CDCl3),啄:8郾73(s,4H),8郾59(s,6H),8郾45(d,4H),8郾33(s,4H),8郾18(s,2H),3郾37(s,9H);ESI鄄MS,m/z:699郾1[M-H]-;元素分析实测值(%,C43H32N4O6计算值):C73郾64(73郾70),H4郾51(4郾60),N8郾06(8郾00).1.2.2摇5,10,15鄄三(4鄄甲氧基羰基苯基)咔咯铁配合物的合成摇将50mg自由咔咯溶解在N,N鄄二甲基甲酰胺(DMF)中,加入200mg氯化亚铁在氩气保护下回流2h,反应后的溶液用二氯甲烷/水(2伊100mL,体积比1颐1)萃取,收集有机相并水洗5~6次,所得粗产物以硅胶为固定相、二氯甲烷为流动相进行柱层析,即得羧酸酯咔咯铁配合物,产率85%.UV鄄Vis(CH2Cl2),姿max/nm:389;MALDI鄄TOF,m/z:753郾031[M]-;元素分析实测值(%,C43H29N4O6Fe计算值):C68郾61(68郾54),H3郾92(3郾88),N7郾51(7郾43).1.2.3摇5,10,15鄄三(4鄄羧基苯基)咔咯铁配合物的合成摇将合成的羧酸酯咔咯铁配合物溶解在100mL甲醇/四氢呋喃(体积比为2颐1)中,加入6mL40%的氢氧化钾水溶液,于40益下搅拌反应2h,用5%盐酸酸化后用四氢呋喃/二氯甲烷/水(体积比1颐1颐2)萃取,收集有机相并水洗3~5次,减压蒸馏后所得产物即为5,10,15鄄三(4鄄羧基苯基)咔咯铁配合物,产率89%.UV鄄Vis(Tris鄄HCl缓冲溶液玉,5mmol/LTris,50mmol/LNaCl,pH=7郾2),姿max/nm:384;MALDI鄄TOF,m/z:711郾014[M]-;元素分析实测值(%,C40H23N4O6Fe计算值):C67郾40(67郾53),H3郾32(3郾26),N7郾73(7郾87).1.3摇配合物与ct鄄DNA的相互作用所有相关测定均是在Tris鄄HCl缓冲溶液玉中进行.ct鄄DNA浓度通过测定其紫外吸收光谱来确定,ct鄄DNA在260nm处的摩尔消光系数为6600mol-1·cm-1·L[34].以缓冲溶液玉为空白,取少量配合物母液加入3mL缓冲溶液中使配合物浓度为1郾0伊10-5mol/L,每次用注射器注入2滋L浓度为1郾5伊10-3mol/L的DNA储备液,使ct鄄DNA与配合物浓度的比值不断增加.每次注入DNA混合均匀5min后,在300~800nm范围内检测配合物紫外鄄可见光谱的变化.由于咔咯铁的配合物自身没有荧光,本文采用EB竞争的方法间接探究配合物与DNA的相互作用.在EB鄄DNA([EB]=5郾0伊10-6mol/L,[DNA]=3郾0伊10-5mol/L)的溶液体系中,每次加入2滋L浓度3642摇No.11摇张摇阳等:水溶性羧酸咔咯铁(芋)配合物对DNA的氧化断裂作用为7郾5伊10-4mol/L的配合物溶液,混合均匀5min后,测500~700nm范围内的荧光强度变化(姿ex=370nm).采用固定ct鄄DNA浓度滴加配合物的方法,取浓度为1郾5伊10-4mol/L的DNA缓冲溶液于石英比色皿中,每次加入3滋L浓度为2郾5伊10-3mol/L的配合物母液,混合均匀5min后测量220~600nm范围内ct鄄DNA的圆二色(CD)谱变化.采用乌氏黏度计,用恒温槽将温度控制在(30依0郾1)益.将ct鄄DNA浓度固定在1郾0伊10-4mol/L,逐渐增加Fe芋TCPC的浓度,测量不同浓度下溶液流经毛细管的时间,按下式计算黏度(浊):浊=(t-t0)/t0(1)式中,t0为缓冲溶液流经毛细管所需的时间,t为DNA溶液(包括含不同浓度配合物的DNA溶液)所需的时间.以(浊/浊0)1/3对[Fe芋TCPC]/[DNA]的比值作图,浊0为DNA溶液的相对黏度.1.4摇铁咔咯配合物对pBR322DNA的氧化断裂作用采用10滋L的反应体系,其中含有pBR322DNA(0郾1滋g)和不同浓度的Fe芋TCPC,同时加入过氧化氢(H2O2)或叔丁基过氧化氢(TBHP)作为氧化剂.避光反应30min后加入2滋L上样缓冲溶液以终止反应,琼脂糖凝胶电泳2h(70V,30mA)后,放入EB中染色10min,用水冲洗后放入凝胶成像系统中成像.2摇结果与讨论2.1摇铁咔咯配合物与ct鄄DNA相互作用的紫外鄄可见光谱配合物与DNA的结合对配合物的核酸酶活性具有重要作用,通常与DNA具有强结合的配合物具有更高的核酸酶活性,而当小分子与DNA发生特异性结合时,其对DNA的断裂也表现出选择性,因此研究配合物与DNA的相互作用对探究其核酸酶活性具有重要意义.通常,配合物与DNA作用有4种基本作用方式,即沟结合、配位键合、嵌入或插入以及双功能方式[35].Fig.2摇UV鄄VisspectraofFe芋TCPC(1伊10-5mol/L)up鄄ontheadditionofct鄄DNAinTris鄄HClbuffer[DNA]/(滋mol·L-1):a.0,b.2,c.6,d.10,e.14郾Fig.3摇Relationshipof[DNA]/着a-着fand[DNA]abouttheinteractionbetweenFe芋TCPCandct鄄DNA配合物与DNA结合后其所处环境发生变化,从而导致吸收光谱的变化,通常结合的强弱可通过光谱的变化幅度得以反映.对于卟啉类大环化合物,当分子以插入模式与DNA作用时,其UV鄄Vis光谱会出现明显红移(逸15nm)和较大的减色效应(逸35%);若卟啉分子与DNA发生外部结合时,吸收光谱则出现较小的红移(臆8nm)和较小的减色(臆10%)或增色效应;而当配合物与DNA发生自堆积的外部结合时,UV鄄Vis光谱将出现较小的红移和中等程度的减色效应[36].图2示出了随着ct鄄DNA的加入,铁咔咯配合物UV鄄Vis光谱的变化.可见,随着ct鄄DNA浓度的增加,铁咔咯Soret带吸收强度不断降低,最终减色在8郾7%左右,同时红移4nm.表明铁咔咯与ct鄄DNA的相互作用较弱,初步推测为一种外