酶联免疫吸附试验(ELISA)

酶联免疫吸附试验(ELISA)测定方法•ELISA概述•ELISA基本原理•ELISA试剂的组成•ELISA测定方法•ELISA实验过程•ELISA在食品检测中的应用•ELISA在国外研究进展ELISA概述enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISAELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品中抗生素检测的试剂盒产品。酶联免疫吸附试验测定法和其他免疫方法一样，都是以抗体和抗原的特异性结合为基础，其差别在于酶联免疫方法以酶或者辅酶作为标记物来标记抗原或抗体，用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应。其最大的特点是利用聚苯乙烯微量反应板（或球）吸附抗原或者抗体使之固相化，在其中进行免疫反应和酶促反应。ELISA基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗体的形成）在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与干扰物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离）加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）ELISA基本原理图示洗涤的方法将固相载体上的复合物与其他物质分离将抗原或抗体固定于合适的载体上，并保持其生物活性使抗原或抗体与某种酶连接，形成酶标抗原或抗体加入酶反应底物，复合物上的酶催化底物使其分解，氧化或还原成有色产物待测样品与酶标抗原或抗体反应ELISA试剂组成完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）（3）酶的底物（4）系列参考标准品（定量测定）（5）酶标记物及样本的稀释液（6）洗涤液（7）反应终止液1.固定载体固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。2.免疫吸附剂已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。3.酶标记物即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还要有良好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)4.酶的底物HRP的底物常用的供氢体有邻苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(TMB)。OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02%H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用。5.洗涤液洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。6.酶反应终止液常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。7.参考标准品定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。ELISA测定方法ELISA常用测定方法主要直接法和间接法。直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作用，加入底物后，显色，其颜色深浅与样本中抗原量成正比；间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与待检测样本中的抗体作用，加入酶底物，显色，颜色深浅与样本中抗体量成正比。ELISA大致分为三类：（1）测定抗体的间接法。（2）测定抗原的双抗体夹心法。（3）测定抗原的竞争法。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品分析。ELIZA方法图示间接法“Indirect”ELISAThestepsofindirectELISAfollowsthemechanismbelow:1.Abufferedsolutionoftheproteinantigentobetestedforisaddedtoeachwellofamicrotiterplate,whereitisgiventimetoadheretotheplasticthroughchargeinteractions.2.Asolutionofnon-reactingprotein,suchasbovineserumalbumin,orcaseinisaddedtoblockanyplasticsurfaceinthewellthatremainsuncoatedbytheproteinantigen.3.Thentheserumisadded,whichcontainsamixtureoftheserumdonor'santibodies,ofunknownconcentration,someofwhichmaybindspecificallytothetestantigenthatiscoatingthewell.4.Afterwards,asecondaryantibodyisadded,whichwillbindanyantibodyproducedbyamemberofthedonor'sspecies(forexample,anantibodyproducedinamousethatwillbindanyrabbitantibody).Thissecondaryantibodyoftenhasanenzymeattachedtoit,whichhasnoeffectonthebindingpropertiesoftheantibody.5.Asubstrateforthisenzymeisthenadded.Often,thissubstratechangescoloruponreactionwiththeenzyme.Thecolorchangeshowsthatsecondaryantibodyhasboundtoprimaryantibody,whichstronglyimpliesthatthedonorhashadanimmunereactiontothetestantigen.Thiscanbehelpfulinaclinicalsetting,andinR&D.6.Thehighertheconcentrationoftheprimaryantibodythatwaspresentintheserum,thestrongerthecolorchange.Oftenaspectrometerisusedtogivequantitativevaluesforcolorstrength双抗体夹心法非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇SandwichELISAAless-commonvariantofthistechnique,calledsandwichELISA,isusedtodetectsampleantigen.Thestepsareasfollows:1.Prepareasurfacetowhichaknownquantityofcaptureantibodyisbound.2.Blockanynonspecificbindingsitesonthesurface.3.Applytheantigen-containingsampletotheplate.4.Washtheplate,sothatunboundantigenisremoved.5.Applyenzymelinkedprimaryantibodiesasdetectionantibodieswhichalsobindspecificallytotheantigen.6.Washtheplate,sothattheunboundantibody-enzymeconjugatesareremoved.7.Applyachemicalwhichisconvertedbytheenzymeintoacolororfluorescentorelectrochemicalsignal.8.Measuretheabsorbencyorfluorescenceorelectrochemicalsignal(e.g.,current)oftheplatewellstodeterminethepresenceandquantityofantigen.AsandwichELISA.(1)Plateiscoatedwithacaptureantibody;(2)sampleisadded,andanyantigenpresentbindstocaptureantibody;(3)enzymelinkedcaptureantibodyusedasdetectingantibodyisadded,andbindstoantigen;(4)substrateisadded,andisconvertedbyenzymetodetectableform.竞争法如下图所示.在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时加入酶标记物和待检样本（抗原），酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物通过洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化还原成为有色的产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标记物结合加入底物后呈色较深，当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标记物共同竞争抗体的结合位点，酶标抗原的比例越高，结合在固相抗体上的酶标抗原就越多，酶标抗原的比例越低，结合在固相上的抗体就越少，而在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从而进一步得知样本中抗原的多少。这就是竞争法ELISA的原理。測定孔EEEEE底物溶液对照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶标记物底物溶液參考液(不含抗原)EE樣本(含抗原)CompetitiveELISAAthirduseofELISAisthroughcompetitivebinding.ThestepsforthisELISAaresomewhatdifferentthanthefirsttwoexamples:1.Unlabeledantibodyisincubatedinthepresenceofitsantigen.2.T