液相色谱实例分析 液相色谱常见问题及故障排除经验

氨基酸分析系统氨基酸分析系统NH2RCCOOHH氨基酸衍生化方法•柱后衍生•柱前衍生氨基酸衍生化后的氨基酸试剂色谱柱检测器色谱柱检测器氨基酸试剂色谱柱检测器柱后衍生色谱柱:阳离子交换柱试剂:茚三酮方法---UV/VIS检测器OPA方法---荧光检测器氨基酸衍生化色谱柱检察器柱前衍生异硫氰酸苯脂（PITC）Column:ReveredPhaseColumn(ODS)Reagent:OPA(Fluorescence)FMOC(Fluorescence)Fluorescamine(Fluorescence)DANS-Cl(Fluorescence)PITC(UV)柱前衍生步骤1.200uL样品中加入100mM异硫氰酸苯酯（乙腈溶液）100uL和1M三乙胺（乙腈溶液）100uL,室温下放置反应1小时2.反应液中加入400uL己烷3.放置，取下层溶液用一次性滤膜过滤器（0.45um）过滤4.取滤液4uL注入液相色谱常见问题及故障排除经验液相系统维护流程图吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器手动进样器检测器色谱柱等度系统储液瓶脱气机泵单元手动进样器色谱柱检测器废液瓶1234567储液瓶脱气机泵单元自动进样器色谱柱检测器废液瓶低压梯度单元混合器低压梯度系统123456789储液瓶脱气机泵单元自动进样器色谱柱检测器废液瓶混合器高压梯度系统12345678液相色谱故障排除经验•故障的确定—至少要重复出现两次以上•初步判断故障引起的原因—方法或硬件•由经验或平时的积累确定故障原因—平时做好观察和记录•当不能确认故障原因时—采用排除法逐一考察可能引起故障的因素•确定故障能否自行处理—不要贸然拆卸不熟悉的部件常见故障因素•仪器环境：—实验室的温度、湿度、酸度等—实验室震动、灰尘等问题—电源及地线问题•使用条件：—流动相（pH值、均匀度、气泡等）—样品（样品分解、氧化、样品溶剂等）—色谱柱（污染、堵塞、塌陷等）•硬件问题：—输液泵—进样器—检测器平常保养-做好平常的保养可以有效的降低故障的发生率-做好平常的保养可以延长仪器的使用寿命常做的保养—保证仪器的使用环境（经常清洁仪器，尤其是灰尘）—泵的保养（使用缓冲盐时要清洗柱塞，水和盐不要长期保存在泵里）—进样器要经常清洗，避免污染物吸附或堵塞管路—尽量进行样品前处理—色谱柱要定期清洗，保证柱效及使用寿命—系统中不要长期保存水和盐，长时间不用时应将仪器所有部分全部更换为70％以上的甲醇，避免细菌的滋生及盐的析出。液相色谱常见问题压力异常（偏高、波动）漏液保留时间漂移基线问题（漂移、噪声）峰形异常压力压力是液相色谱中最重要的指标，要经常关注压力的变化。保留时间的变化经常是由于压力问题引起的。不同溶剂即使在相同流速和温度的情况下压力也是不同的。记下仪器正常状态时，在固定条件下（流动相、流速、温度等）的压力显示值。压力过高时首先要确认是色谱柱堵塞还是系统堵塞色谱柱堵时，确认可能造成堵塞的样品的性质，相应选择合适的清洗溶剂。系统堵塞，首先应确认是哪一部份堵塞，依据情况由后向前进行排除。容易发生堵塞的部件保护柱及色谱柱线路过滤器混合器过滤组件管路连接处进样器检测器流通池压力过低如果压力为零：泵头中没有液体，充满气泡单向阀完全堵死泵的柱塞杆折断压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力)如果有压力但是压力比正常时低：漏液单向阀堵塞压力波动压力在短时间内剧烈波动。泵头中有气泡单向阀脏柱塞密封圈漏液经常漏液的部件泵：柱塞密封圈,排液阀手动进样器：转子密封圈磨损检测器：流通池窗口（垫片损坏、透镜破碎）接头处漏液：（接头松动，接头脏，接头磨损，部件不匹配）保留时间不稳定吸滤头脏泵输液不正常（压力波动、气泡等）流动相组分变化流动相缓冲能力不够色谱柱平衡时间不够柱温的变化柱子问题噪音大流动相污染、变质或由低品质溶剂配成漏液流动相、泵、检测器流通池内有气泡流动相各溶剂不相溶或混和不均匀检测池能量不足流通池被污染温度影响（检测器和柱温差别太大）其他电子设备的影响或电源、地线等基线漂移流动相污染，变质或由低品质溶剂配成流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂)温度波动系统平衡时间不够流通池被污染或有气泡流通池窗口破裂峰形问题死体积太大柱子被污染或堵塞色谱柱塌陷流动相缓冲不足或不合适样品溶剂选择不当，与流动相之间极性差异太大样品过载（浓度或体积）柱温过低鬼峰流动相被污染进样阀残余峰样品中未知物色谱柱中的污染物管线选择材料不锈钢Teflon(聚四氟乙烯)PEEK(聚醚醚酮)尺寸0.1mmI.D.x1.6mmO.D.0.3mmI.D.x1.6mmO.D.0.5mmI.D.x1.6mmO.D.0.8mmI.D.x1.6mmO.D.管线材料不锈钢(可用于所有连接)–能承受几千kgf/cm2压力–酸性或高浓度盐环境中易腐蚀(尤其在pH小于2时)PEEK(可用于所有连接)–能承受高达250kgf/cm2压力–可在整个PH范围(pH1-14)内使用–不适用于高溶解性溶剂如氯仿等Teflon(用于柱后阻尼管、反应管和排液管)–化学惰性大–能承受5kgf/cm2压力接头不锈钢接头/垫圈主要用于输液泵、进样器的连接–能承受400kgf/cm2压力–一旦固定，垫圈不可再动PEEK接头主要用于色谱柱、检测器的连接–易于安装–能承受250kgf/cm2压力–容易产生死体积不锈钢接头垫圈PEEK接头死体积•死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题.管线公螺母死体积好的连接差的连接选择原则•采用“HPLC”级溶剂•避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂•对试样有适宜的溶解度•溶剂粘度要小•与检测器相匹配流动相水/甲醇梯度ODS柱鬼峰鬼峰的出现流动相•水的等级–纯化水–蒸馏水–去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率流动相流动相的更换不互溶的流动相不能直接更换缓冲盐不能直接用有机溶剂更换水正己烷异丙醇缓冲盐有机溶剂水过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。溶剂前处理吸滤头吸滤头材料：不锈钢(或陶瓷)烧结，孔径10um故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成措施：用异丙醇（或5％稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗LC20AT主入口阀部件号:228-45704-92LC20AD入口阀LC20AT副入口阀部件号:228-45704-91LC20AD出口阀部件号:228-45705-91单向阀LC10ADvp出口阀LC10ATvp出口阀部件号:228-34976-91LC10ADvp入口阀部件号:228-39093-92LC10ATvp入口阀部件号:228-32166-91进样器•自动进样器•手动进样器(7725/7725i）原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入7725i手动进样阀色谱柱的日常保养购买新柱后一定要仔细阅读说明书，确认柱的使用条件以及清洗再生步骤，按照说明书条件测试色谱柱柱效，记录使用压力定期检测柱压和柱效不同流动相之间转换时应注意溶剂的互溶性确认样品不会在流动相中析出或带有固体不溶物，请使用0.45um或0.2um的一次性滤膜过滤样品，或者进行前处理。为了延长色谱柱使用寿命，请使用保护柱。定期用合适的溶剂清洗或再生色谱柱长期不用时，清洗干净后，使用柱子说明书中指明的溶剂保存。柱子要从仪器上卸下并用堵头密封后保存。定期用合适的流动相清洗保存的柱子，避免干涸。峰产生有肩或分叉的原因1.柱子劣化（进口处产生不均匀的空隙）2.溶剂效应3.样品劣化（生成氧化物、分解物等）判断标准所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化峰的变形根部变宽有肩或分叉溶解样品的溶剂选择不当最好不要选择高溶解性的试剂作为溶解样品的溶剂甲醇作为溶剂20uLCaffeine乙醇作为溶剂20uLCaffeine乙醇作为溶剂10uLCaffeine最好注入少量样品溶解性效应低溶解性溶剂高溶解性溶剂检测器基线异常基线噪音异常大–气泡未脱出–检测器污染–灯老化出现漂移或不规则波动–系统污染，如色谱柱、管路、检测器和流动相等等产生规则波动–室温变化，如空气调节器直吹检测器–泵的脉动紫外灯的保养氘灯保证寿命为2000小时保证仪器的使用环境在分析前、柱平衡得差不多时，再打开检测器紫外灯；不要频繁的开关紫外灯，同样会损害紫外灯的寿命。一般间隔时间在三小时以上时检测池背压使用0.3mmIDx2m塑料管作为阻尼管连接于检测器出口，否则检测池中会有气泡产生连接阻尼管之前，必须先确认检测池能够承受的压力