液相色谱柱的选择

液相色谱柱的选择与使用液相色谱柱的选择与使用目录ƒ一、液相色谱柱的选择ƒ1、分离模式的选择ƒ2、C-18柱的性能影响因素ƒ3、保留值与pH的关系ƒ二、液相色谱柱的安装ƒ1、液相色谱柱的结构ƒ2、色谱柱的安装ƒ三、液相色谱柱的使用ƒ1、样品的前处理ƒ2、流动相的配制ƒ3、色谱柱的平衡ƒ4、流动相流速的选择ƒ四、分析条件调整的影响ƒ五、液相色谱柱的维护色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理色谱柱高压泵检测器色谱工作站进样器液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。一、液相色谱柱的选择ƒ1、分离模式的选择样品溶于有机溶剂溶于水溶于四氢呋喃非离子化离子化溶于有机溶剂溶于水溶于正己烷溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水用硅胶的正相模式用键合相的正相模式用键合相的反相模式用键合相的反相模式低分子凝胶渗透色谱用键合相的反相模式抑制电离反相键合相色谱离子对键合相的反相模式用硅胶的正相模式离子交换模式凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱大孔填料的离子交换模式用大孔填料的反相模式分子量2,000分子量2,000正相&反相色谱ƒ正相色谱20%反相色谱80%正相吸附色谱极性:固定相流动相固定相-极性流动相(己烷,庚烷)-非极性极性物质后出峰反相分配色谱极性:固定相流动相固定相-非极性流动相(甲,乙醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-极性非极性物质后出峰柱填料基质•硅胶基质-pH3~8•Al2O3.nH2O-pH1~14•聚合物基质-pH1~14高或低pH下,硅胶会溶解化学修饰困难孔结构复杂,孔径不均匀，导致柱效不够高,有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损2、C-18柱的性能影响因素：物理性质•硅胶纯度•色谱柱尺寸•颗粒形状•粒径•表面积•孔径•键合类型•碳覆盖率•封端化学性质C-18柱的性能影响因素：色谱柱物理性质硅胶纯度•填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸•填料床的长度和内径颗粒形状•球型或不规则型粒径•平均颗粒直径,通常3-10µm表面积•颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/gram表示孔径•颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300ÅC-18柱的性能影响因素：硅胶纯度（以安捷伦柱为例）二氧化硅NaKMgAlCaTiFeZrCuCrZnZorbaxRx-SIL10341.52nd3ndndnd1ZorbaxSIL17ndnd5793221881nd88Nucleosil56N/AN/And1305776ndN/AN/AndHypersil2900N/A403003865230N/AN/AN/AN/And=未检出金属浓度（ppm)A类硅胶OriginalZORBAXSIL(1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa低),导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶(高纯)ZORBAXRx-Sil(1987)由于金属含量低,硅羟基pKa高,碱性化合物不发生拖尾ZorbaxRx-SIL:11种金属35ppm(未检出其他杂质,1ppm);99.995%纯度的二氧化硅C-18柱的性能影响因素：柱尺寸色谱柱尺寸对色谱分离的影响：•短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低•长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长•窄径柱(≤2.1mm)-检测器灵敏度高•宽径柱(3-21.2mm)-载样量高C-18柱的性能影响因素：颗粒形状与大小颗粒形状---对色谱分离的影响当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时,球型颗粒可降低柱压,延长色谱柱寿命球形不规则形粒径---对色谱分离的影响较小的颗粒柱效较高,但会引起柱压过高.3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品,而组份单一的样品多采用5µm的粒径1.8µm3.5µm5µm7µm10µmC-18柱的性能影响因素：表面积与孔径表面积---对色谱分离的影响高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力,柱容量和分离度.表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态,对于梯度淋洗尤为重要孔径---对色谱分离的影响大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间,达到充分分离,改善峰形样品MW≤4,000,选择80Å的孔径样品MW4,000,选择300Å的孔径大孔径填料适用于大分子分析ƒ大孔径300Å全多孔色谱柱ƒ可用于分离蛋白质和多肽ƒ分子量虽小但hydrodynamicvolume(水动力学体积)较大的分子ƒPoroshell色谱柱ƒ高流速下,高柱效分析大分子的蛋白质和多肽色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔,与孔内表面的键合相进行分离分配300Å孔径可改善蛋白质和多肽峰形0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300SB-C18(300Å)SB-C18(80Å)PW1/2LeuEnkephalinM.W.=556AngiotensinII(血管紧张素II)M.W.=1046InsulinBM.W.=3,496CytCM.W.=12,327Rnase(核糖核酸酶)M.W.=13,684Lysozyme(溶菌酶)M.W.=13,900孔径,分子量对峰宽的影响(梯度分离)选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形300Å孔径可改善大分子的峰形色谱柱:4.6x150mm,5mm流动相:60%MeOH:40%0.1%三氟乙酸流速:0.75mL/min温度:RT检测器:UV282nm•溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径•窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍SB-C3(80Å)300SB-C3(300Å)Pw1/2=0.442Pw1/2=0.125OONHOHOCHOHOOHOHOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3CH3CH3C0510Time(min)0510Time(min)Tylosin(泰乐菌素)MW.926分子量虽小但hydrodynamicvolume(水动力学体积)较大的分子C-18柱的性能影响因素：色谱柱化学性质键合类型•单体键合-键合相分子与基体单点相连•聚合体键合-键合相分子与基体多点相连碳覆盖率•与基体物质相连的键合相的量封端•键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来C-18柱的性能影响因素：键合类型键合类型对色谱分离的影响：：单齿键合：提高传质速率,加快色谱柱平衡双齿键合：增加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样量CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOOC-18柱的性能影响因素：碳覆盖率碳覆盖率---对色谱分离的影响高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长低碳覆盖率：缩短运行时间封端---对色谱分离的影响封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品,未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异固定相键合二甲基硅烷封端四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,C18,etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3++ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)传统键合及封端技术3、保留值与pH的关系pH变化值0.1RS变化值1.6色谱柱：ZorbaxStableBondC184.6X250mm,5um部件号：880975-906流动相：27%甲醇：73%磷酸pH2.5&2.6温度：500C流速：1.0mL/min.保留值与pH的关系12346750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH7.00pH7.25色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C84.6x75mm,3.5µm流动相:44%25mM磷酸,pH7.00:56%甲醇流速:1.0mL/min温度:25°C检测:UV250nm•可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化—甚至很小的0.05–0.25个pH变化单位.样品:1.ketoprofen2.ethylparaben3.Hydrocortisone4.fenoprofen5.propylparaben6.Propranolol7.ibuprofen0.25个pH保留值与pH的关系pH变化：0.2个pH(7.0~7.2)保留时间改变：1.2分钟(13.6~14.8分钟)保留时间随pH改变不明显保留时间随pH改变不明显(酸性环境中)保留值与pH的关系保留时间酸性组份中性组份碱性组份保留值与pH的关系StableBondC18pH1~8Bonus-RPpH2~9ExtendC18pH2~11.5EclipseXDBC18pH2~9复杂组分的流动相pH选择技巧色谱柱:ZORBAXExtend-C184.6x150mm,5mm流动相:30%缓冲液:70%MeOHpH7缓冲液20mMNa2HPO4pH11缓冲液20mMTEA流速:1.0mL/min温度:RT检测器:UV254nm0512,345Time(min)76Extend-C18pH71.Maleate马来酸盐2.Scopolamine东莨菪碱pKa7.63.PseudoEphedrine假麻黄碱pKa9.84.Doxylamine抗敏安(多西拉敏)pKa9.25.Chlorpheniramine氯苯吡胺pKa9.16.Triprol内径ine苯丙烯啶pKa6.57.Diphenhydramine苯海拉明pKa9.0Extend-C18pH1105101234Time(min)657高pH下,碱性成分的保留增加待测物pKa+1.5以的流动相pH可保证方法的稳定键合相-适用pH范围StableBond,pH1-81.使用空间位阻大的硅烷2.未-封端EclipseXDB,pH2-91.致密键合的二甲基烷基硅烷2.专利技术双-封端Bonus-RP,pH2-91.极性烷基固定相2.使用空间位阻大的硅烷3.三封端Extend-C18,pH2-11.51.独特的双齿键合结构2.双封端SiOSiOSilicaSupportC18C18SiONHOSilica-based色谱柱PackingwithAlkyl/am内径eStationaryPhaseORRSiOHSiOSiRRROOHRCHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333ORSiSiOSiORR1CH3CH3CH3CH3RR1CH3R1R1R1CH3R111SiSiPGPGPGR1R1极性官能团低pH下,分析酸性、碱性和中性组分,峰形优异,柱寿命长中等pH下,分析酸性、碱性和中性组分,尤其碱性组分峰形优异,柱寿命长中等pH下,分析酸性、碱性和中性组分,可用于100%全水相,尤其极性组分峰形优异,柱寿命长中~高pH下,分析酸性、碱性和中性组分,尤其碱性组分峰形优异,柱寿命长二、色谱柱的安装液相色谱柱的安装ƒ1、液相色谱柱的结构：ƒ（1）空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压环用于密封。3／16英寸的内螺纹与1／16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。液相色谱柱的安装在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间