分子生物学实验指导(精)

分子生物学实验指导生物技术教学室编宁夏大学生命科学学院2008年8月1实验一分子生物学实验技术多媒体演示[目的要求]通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。[教学方式]多媒体光盘演示。[实验内容]基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。2实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA[目的要求]通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术[实验原理]琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidumbromide,EB），在紫外光下可以检出10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。琼脂糖凝胶有如下特点：(1)DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。(2)琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。(3)电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。(4)电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。(5)嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。(6)离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。3对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。[实验仪器与设备]1.恒温培养箱2.琼脂糖凝胶电泳系统3.高压灭菌锅4.紫外线透射仪[实验材料]1.三羟甲基氨基甲烷（Tris）2.硼酸3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.溴酚蓝5.蔗糖6.琼脂糖7.溴化乙锭8.DNAmarker9.DNA样品[实验步骤]1.缓冲液的配制①5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)配1000mL5×TBE:Tris54g硼酸27.5g0.5mol/lEDTA20mLPh8.0②凝胶加样缓冲液(6×)溴酚蓝0.25%蔗糖40%③溴化乙锭溶液(EB)0.5μg/mL2.制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度线性DNA的有效分离范围0.3%5-60kb0.6%1-20kb0.7%0.8-10kb0.9%0.5-7kb1.2%0.4-6kb1.5%0.2-4kb2.0%0.1-3kb43.胶板的制备(1)用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘（或电泳装置所皿备的塑料盘的开口）封住，形成一个胶膜（将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正）。(2)配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液（1×TBE）。准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移率。(3)在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。(4)使溶液冷却至60℃。加入溴化乙锭（用水配制成10mg/mL的贮存液）到终浓度为0.5ug/mL，充分混匀。(5)用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。(6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。(7)在凝胶完全凝固后（于室温放置30-45分钟），小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4℃，并在冷库中电泳。(8)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。4．加样DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。每个孔的最大加样量，依据DNA的数量及大小而定，一般为20-30μL样品。已知大小的DNA标准，应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。确定未知DNA的大小。测量未知DNA的大小时，要所有样品都用相同的样品缓冲液。5．电泳在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,但是,在电场增加时,不同相对分子质量的DNA片段泳动速率不同。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有5效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝指示剂移到距离胶板下沿约1-2cm处，停止电泳。[作业]1．在波长为254nm的紫外灯下,观察染色后的电泳凝胶。2．采用透射紫外光拍照，照相机镜头加近摄光圈和红色滤光片（580-600nm）,距离50-60cm。采用全色胶卷，5.6光圈,10-20S。（或采用凝胶成像系统，将图片以文件的形式保存）6实验三DNA的粗提取与鉴定[目的要求]学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。[实验原理]DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。[实验仪器与设备]1.铁架台2.玻璃棒(1个)3.滤纸4.量筒（100mL，1个）5.烧杯(100mL1个,50mL和500mL各2个)6.试管（20mL，2个）7.漏斗(1个)8.试管夹(2个)9.纱布(15块)10.离心机(1台)[实验材料]1.鸡血细胞液（5mL~10mL）2.95%乙醇（预冷24h）3.蒸馏水4.柠檬酸钠(质量浓度0.1g/mL)5.氯化钠(2mol/L和0.015mol/L)6.二苯胺7.高氯酸8.乙醛9.冰乙酸[实验步骤]实验前需要制备鸡血溶液，制备的方法是：取柠檬酸钠的质量浓度为0.1g/mL的溶液（抗凝剂）100mL，置于500mL烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血（约180mL）注入烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。然后，将血液倒入离心管内，用1000rpm离心2min，此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时，用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液（如果没有离心机，可以将烧杯中的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀）。71．提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液5mL~10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL的烧杯中，取其滤液。2．溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液40mL加入到滤液中，并摇动烧杯，使其混合均匀，这时DNA载溶液中呈溶解状态。3．析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量的浓度相当于0.14mol/L）。4．滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上。5．将DNA的粘稠物再溶解取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。6．过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。7．提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95%的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含有杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。注意观察丝状物是什么颜色。8．DNA的鉴定取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0.015mol/L的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。将观察的结果填写在《实验报告册》上。8[作业]1.步骤8的2支试管中溶液颜色的变化说明了什么?将得出的结论填写在《实验报告册》上。2．提取鸡血中的DNA时,为什么要除去血液中的上清液?3.步骤1和步骤3中都需要加入蒸馏水,两次加入的作用相同吗?为什么?9实验四质粒DNA的制备[实验目的]通过本实验，学习和掌握碱裂解法提取质粒。[实验原理]碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复PH至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，在而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。[实验仪器与设备]1.恒温培养箱2.恒温摇床3.台式离心机(最大转速4000rpm)4.冷冻高速离心机5.高压灭菌锅6.超净工作台7.微量移液器8.eppendorftub、tip[实验材料]1.葡萄糖2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.氢氧化钠5.十二烷基硫酸钠(SDS)6.乙酸钾7.冰乙酸8.氯仿9.乙醇10.胰RNA酶11.氨苄青霉素12.蔗糖13.溴酚蓝14.酚15.β巯基乙醇16.盐酸17.含pUC18质粒的大肠杆菌10附：试剂的配制1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖5mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）2.溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合3.溶液Ⅲ5mmol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL4.TE缓冲液10mmol/LTris·HCl1mmol/LEDTA(pH8.0)5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)6.胰RNA酶将RNA酶溶于10