qPCR技术概述

RNA提取和荧光定量概述邮箱：[e-mail]电话：187102808402020/6/161目录第一部分：RNA提取RNA的重要性RNA提取的方法RNA质量的鉴定第二部分：荧光定量荧光定量的原理和方法荧光定量的应用市场上常见的荧光定量产品2020/6/1622020/6/163从RNA开始到基因拷贝数的定量或者表达研究，已经成为大多数实验的主流设计方案，也是RNA相关课题研究的首选思路。完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、RNA芯片，mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。1.RNA提取的重要性2020/6/1641.RNA提取的重要性2.RNA提取方法2020/6/165细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂（SDS、胍盐等),迅速破坏细胞结构，抑制RNA酶的活性，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。通过有机溶剂（酚、氯仿等）处理可以使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。2.RNA提取方法2020/6/166欲提取RNA的样本释放出RNA得到纯化的总RNA对RNA保存异硫氰酸胍，胍盐/β-巯基乙醇等，对细胞进行裂解有机溶剂或硅基质吸附等方法对RNA进行纯化2.RNA提取方法—样品准备2020/6/167样本最好用新鲜或者速冻(不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中)的没有经过反复冻融的样本。样品预处理方式：不同来源的样品（如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织、细胞等）因细胞结果不同预处理方式亦有所不同。一般处理方式如下：1.植物材料—液氮研磨2.动物材料—匀浆(液氮条件下)、液氮研磨3.细菌—溶菌酶破壁2.RNA提取方法—细胞裂解异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）:1.TRIzol方法，Invitrogen公司最先开发，应用于大部分动植物材料，但对次生代谢较多的植物材料，RNA提取效果较差。2.异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将RNA释放到溶液中。3.而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。2020/6/168基因组DNA水相有机相RNA2.RNA提取方法—细胞裂解胍盐/β-巯基乙醇法：1.Qiagen公司最先开发,此方法适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。2.胍盐使细胞充分裂解，β-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程可以抑制RNase的活性，保护RNA不被降解2020/6/1692.RNA提取方法—细胞裂解2020/6/1610其他方法：有些植物材料多糖多酚，如植物果实，番茄叶子等；有些植物木质化程度较高，如根茎等组织，这些都会导致RNA提取过程的困难。如：1.纤维组织（心脏，骨骼肌等）由于这些组织细胞密度低，单位重量组织中RNA含量低，所以需要增加起始量。2.蛋白/脂肪含量高的组织（脑，油菜，菜籽等）如果抽提后上清含白色絮状物，需要重新抽提。2.RNA提取方法—纯化2020/6/1611纯化原则：1.消除RNA样品中存在的对酶（如逆转录酶）有抑制效应的有机溶剂和高亮度的金属离子。2.避免其它生物大分子如蛋白质、多糖、脂类分子的污染。3.排除DNA分子的污染2.RNA提取方法—纯化有机溶剂抽提法1.抽提：常用氯仿，以去除蔗糖、蛋白等杂质2.沉淀：用异丙醇或乙醇来沉淀水相中的RNA3.洗涤：75%的乙醇洗涤，去除盐离子4.溶解：加入适量的RNase-freeddH2O2020/6/16122.RNA提取原理—纯化硅基质吸附法利用核酸与硅基质材在高盐条件下结合，低盐条件下脱离的特征。2020/6/16133.RNA评价与鉴定提取RNA后我们需要对RNA进行相关的质量检测，以确定它是否符合后续试验的要求。RNA用于不同的后续试验，对其质量要求不尽相同。如：1.cDNA文库构建：要求RNA完整，且无酶抑制物残留2.Northernblot：对RNA的完整性要求高3.RT-PCR:对酶反应抑制物残留要求严格2020/6/16143.RNA评价与鉴定RNA纯度检测—分光光度计法通过OD260/280来检测RNA的纯度，OD260/230作为参考1.OD260/280在1.9-2.1之间，可以认为RNA的纯度较好；2.OD260/280小于1.8，则表明蛋白质杂质较多；3.OD260/280大于2.2，则表明RNA已经降解；4.OD260/230小于2.0，表明裂解液中有异硫氰酸胍和β-疏基乙醇的残留。2020/6/16153.RNA评价与鉴定rRNA占总RNA的80%-85%，在琼脂糖凝胶上可以清晰的看到28S(23S)和18S（16S）rRNA。当28SrRNA的量约为18SrRNA的两倍的时候，说明RNA的完整性较好2020/6/1616RNA完整性鉴定——琼脂糖凝胶电泳第二部分：实时荧光定量PCR2020/6/1617•在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，•最后通过标准曲线和CT值对未知模板进行定量分析的方法。1.qPCR原理和方法2020/6/1618实时荧光定量PCR是1996年由AppliedBiosysrems公司推出的实验技术；常用的荧光标记方法：1，非特异性荧光标记（染料法）：1、SYBRGreenⅠ2、EvaGreen3、LCGreen2，特异性荧光标记（探针法）：1、TaqMan2、MolecularBeacon3、Amplisensor1.qPCR原理和方法—SYBRBGreenⅠ基本原理:SYBRGreenI是一种结合于所有DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。只有和双链DNA结合后才发荧光，当DNA双链分开，无荧光。2020/6/1619SYBRGreenⅠSYBRGREEN法优缺点优点：1.对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA2.使用方便-----不必设计复杂探针3.非常灵敏4.便宜缺点：1.容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性（但可以通过溶解曲线的分析优化反应条件）2.对引物特异性要求较高2020/6/16201.qPCR原理和方法—SYBRBGreenⅠ1.qPCR原理和方法—SYBRGreen熔解曲线分析利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增。2020/6/1621SYBRGREEN熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确1.qPCR原理和方法—SYBRGreen熔解曲线分析2020/6/16221，融解曲线分析，有杂峰；2，其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确。1.qPCR原理和方法—Taqman探针法1.5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等2.3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)3.探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光4.Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针2020/6/16231.qPCR原理和方法—Taqman探针法2020/6/16241.qPCR原理和方法—Taqman探针法2020/6/1625Taqman探针法优缺点：优点：1.对目标序列高特异性------阴性结果确定2.设计相对简单------与目标序列某一区域互补3.重复性比较好缺点：1.只适合一个特定的目标2.价格较高3.不容易找到本底低的探针1.qPCR原理和方法—MolecularBeacon分子信标2020/6/16261.分子信标是一段荧光标记、具有茎环发夹结构的寡聚核苷酸探针2.环两端各有5-6个核苷酸配对形成茎环结构，5’端报告基团，3’端淬灭基团3.在PCR反应的退火/延伸阶段，分子信标与靶序列特异结合，分子信标由发夹结构变为链状结构1.qPCR原理和方法—Taqman探针法2020/6/1627Taqman探针法优缺点：优点：1.对目标序列高特异性2.——检测SNP最灵敏的试剂之一。3.荧光背景低缺点：1.只适合一个特定的目标2.价格较高3.不容易找到本底低的探针2.qPCR原理和方法—定量原理2020/6/16282.qPCR原理和方法—定量原理2020/6/1629Fluorescence2.qPCR原理和方法—定量原理2020/6/1630Ct值的定义：CT值：C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。CT值由阈值确定2.qPCR原理和方法—定量原理2020/6/1631阈值(threshold)缺省值设定为基线（baseline，即本底信号）范围(3-15个循环)内荧光信号强度标准偏差的10倍。阀值由基线确定2.qPCR原理和方法—定量原理2020/6/1632理想的PCR反应:Xn＝X0*2n1.Xn：第n次循环后扩增产物数量2.X0：起始模板数量3.n：扩增循环数2.qPCR原理和方法—定量原理2020/6/1633非理想的PCR反应:Xn＝X0*(1+En)n1.Xn：第n次循环后扩增产物数量2.X0：起始模板数量3.n：扩增循环数4.En:扩增效率2.qPCR原理和方法—定量原理2020/6/16341.在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M----------------(1)XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M2.方程式(1)两边同时取对数得:lgM=lgX0(1+Ex)*Ct----------------(2)3.整理方程式(2)得:lgX0=-Ct×lg(1+Ex)+lgM----------(3)扩增产物的对数与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。2.qPCR原理和方法—定量原理2020/6/1635荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210•浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量2.qPCR原理和方法—定量原理绝对定量目的是测定未知样品的准确拷贝数或浓度，需要已知准确拷贝数或浓度的标准品，需要制作标准曲线，数据处理比较方便，容易理解。相对定量不需要测定未知样品的准确拷贝数或浓度，只需要知道样品之间的浓度比值。所以，标准品可以是已知准确拷贝数或浓度的标准品，但是，最常用的方法是通过稀释目的基因的PCR产物作为标准品；标准品可有可无。数据处理相对复杂，比较难理解。2020/6/1636绝对定量2020/6/1637•敏感性高:检测低拷贝数样品;•区分小差异样品•大范围拷贝数样品•同时检测:100—1010•省时有效临床检测，转基因检测环境监测等标准曲线法相对定量举例2020/6/1638标准曲线法相对定量举例2020/6/1639设置内标：b-actin、GAPDH等管家基因对靶基因进行均一化：靶基因拷贝／每一个内标基因拷贝双标准曲线法含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线；样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算，并均一化处理，标本间靶基因的表达水平分析2-ΔΔc(t)法标本内靶基因与内标基因Ct值比较：ΔC(t)=C(t)m-C(t)n标本间ΔC(t)比较：ΔΔc(t)＝ΔC(t)1-ΔC(t)2-ΔΔc(t)计算标准曲线法相对定量举例2020/6/1640标准曲线法相对定量举例2020/6/16413.qPCR的应用1，定量分析2，定性分析2020/6/16423.qPCR的应用—定量分析绝对定量分析：DNA或RNA的绝对定量分析1.病原微生物或病毒含量的检测,2.转基因动植拷贝数的检测，3.RN