动物胚胎工程yyd前沿热点技术

第四篇前沿热点技术哺乳动物细胞核移植技术第八章内容目录内容目录„„核移植定义核移植定义„„核移植技术的研究历史及进展核移植技术的研究历史及进展„„哺乳动物核移植技术环节哺乳动物核移植技术环节„„核移植相关理论问题核移植相关理论问题„„核移植应用探讨核移植应用探讨„„问题与挑战问题与挑战一、核移植定义一、核移植定义一、核移植定义核移植是指利用显微外科手术的方法将胚胎核移植是指利用显微外科手术的方法将胚胎细胞或成体细胞的细胞核移入去核的卵母细细胞或成体细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，构建成重组胚，通过体内或体外培养、胞中，构建成重组胚，通过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程，又称动物克隆技术。代的技术过程，又称动物克隆技术。„„实验设想的提出实验设想的提出SpemannSpemann的实验的实验二、核移植技术的发展二、核移植技术的发展„„WeissmannWeissmann提出的问题。提出的问题。„„SpemannSpemann’’ss的实验。的实验。„„1952,RobertBriggs(A)andThomas1952,RobertBriggs(A)andThomasJJ。。King(King(B),B),两栖类核移植获得成功。两栖类核移植获得成功。二、核移植技术的发展二、核移植技术的发展STEP1:SpemanntiedasinglestrandofhairintoanooseandpinchedoffaregionofcytoplasmfromasinglecelledsalamanderembryoSTEP2:Thepartofthecellcontainingthenucleusgrewnormally,anddevelopedintoamulti-celledembryo.TheregionofpinchedcytoplasmremainedunchangedSTEP3:Spemannloosenedthenoose,andallowedanucleusfromoneoftheembryocellstoentertheisolatedregionofcytoplasmSTEP4:Spemannthenseveredthemulti-celledembryofromthecytoplasm.Theregionofcytoplasm,whichnowcontainedanucleus,begantodevelopintoanormalembryo二、核移植技术的发展二、核移植技术的发展核移植技术发展的三个阶段核移植技术发展的三个阶段„„同种胚胎细胞克隆同种胚胎细胞克隆„„同种体细胞克隆同种体细胞克隆„„异种体细胞克隆异种体细胞克隆1952年，美国科学家Briggs和King将发育到后期的青蛙胚胎细胞核植入青蛙卵中获得蝌蚪。60年代，中国科学家童第周用鱼囊胚细胞核移植得到首批克隆鱼，后又获得远缘克隆鱼。1981年Illmensee和Hopps用小鼠胚胎细胞进行核移植，获得了小鼠，但他们的实验没有被重复出来。1986年，Willadsen用胚胎细胞克隆羊获得成功。90年代，我国科学家利用胚胎细胞相继克隆成了兔、羊、猪、牛、小鼠等几种动物。1997年，中国学者孟励在美国首次用胚胎细胞克隆猴获得功。11、同种胚胎细胞克隆、同种胚胎细胞克隆首例胚胎细胞核移植哺乳动物一览表物种时间供体细胞作者小鼠1983原核McGrathJD绵羊19868-细胞卵裂球WilladsenRS兔19878-细胞卵裂球SticeSL牛19872-32细胞卵裂球PratherSM大鼠1988原核KonoT猪1989原核PratherSM山羊19914-32细胞卵裂球ZhangY猴19978-细胞卵裂球MengL核移植技术产生恒河猴核移植技术产生恒河猴2、同种体细胞克隆绵羊,1997Wilmut,I.,Schnieke,A.E.,McWhir,J.,Kind,A.J.&Campbell,K.H.(1997)Nature385,810-813.Mice,(1998)Wakayama,T.,Perry,A.C.,Zuccotti,M.,Johnson,K.R.&Yanagimachi,R.(1998)Nature394,369-374.Cows,(1998)Kato,Y.,Tani,T.,Sotomaru,Y.,Kurokawa,K.,Kato,J.,Doguchi,H.,Yasue,H.&Tsunoda,Y.(1998)Science282,2095-2098Baguisi,A.,Behboodi,E.,Melican,D.T.,Pollock,J.S.,Destrempes,M.M.,Cammuso,C.,Williams,J.L.,Nims,S.D.,Porter,C.A.,Midura,P.,etal.(1999)Nat.Biotechnol.17,456-461Goats,(1999)Pigs,(2000)Polejaeva,I.A.,Chen,S.H.,Vaught,T.D.,Page,R.L.,Mullins,J.,Ball,S.,Dai,Y.,Boone,J.,Walker,S.,Ayares,D.L.,etal.(2000)Nature407,86-90.Pigs,(2000)AkiraOnishi,MasakiIwamoto,TomijiAkita,SatoshiMikawa,KumikoTakeda,TakashiAwata,HirohumiHanada,andAnthonyC.F.PerryScienceAug182000:1188-1190.Cats,(2002)Shin,T.,Kraemer,D.,Pryor,J.,Liu,L.,Rugila,J.,Howe,J.,Buck,S.,Murphy,K.,Lyons,L.&Westhusin,M.(2002)Nature415,859-860.Rabbits,(2002)Chesne,P.,Adenot,P.G.,Viglietta,C.,Baratte,M.,Boulanger,L.&Renard,J.P.(2002)Nat.Biotechnol.20,366-369.CesareGalli,IrinaLagutina,GabriellaCrotti,SilviaColleoni,PaolaTurini,NunziaPonderato,RobertoDuchi,GiovannaLazzariNature2003,424:635GordonL.Woods,KennethL.White,DirkK.Vanderwall,Guang-PengLi,KennethI.Aston,ThomasD.Bunch,LoraN.Meerdo,andBarryJ.PateScience2003:1063Mules,(2003)Horse,(2003)Rats,(2003)QiZhou,Jean-PaulRenard,GaëlleLeFriec,VincentBrochard,NathalieBeaujean,YacineCherifi,AlexandreFraichard,JeanCozziScience,Vol302,20031179FirstcloneddogFirstcloneddog--SnuppySnuppy(2005)(2005)WooSukHwangetal.Nature2005,436:604FerretFerret，，20062006ZiyiLiet.alDevelopmentalBiology体细胞克隆动物一览同种体细胞克隆证明了高度分化的细胞在同种去核卵母细胞的细胞质作用下可以恢复全能性，它提示同种卵母细胞可能具备去分化的因子，异种体细胞克隆则是探讨高度分化的细胞在异种去核卵母细胞的细胞质作用下是否可以恢复全能性，它同时也可探讨异种卵母细胞是否具有非物种差异的去分化因子。3、异种体细胞克隆大熊猫体细胞移入去核兔卵大熊猫体细胞移入去核兔卵TransferringthegiantpandasomaticcellintoTransferringthegiantpandasomaticcellintoenucleatedrabbitenucleatedrabbitoocyteoocyte三、哺乳动物核移植技术环节三、哺乳动物核移植技术环节三、哺乳动物核移植技术环节1.1.卵母细胞的准备卵母细胞的准备2.2.供核细胞的准备供核细胞的准备3.3.核移植核移植4.4.融合融合5.5.激活激活6.6.重构胚胎的体外培养重构胚胎的体外培养7.7.胚胎移植胚胎移植核移植的基本程序小鼠核移植示意图小鼠核移植示意图去除纺锤体和染色体去除纺锤体和染色体供体细胞注入供体细胞核化学活化(SrCl2)IVCIVCETET家畜核移植技术路线11、卵母细胞的准备、卵母细胞的准备„„卵母细胞的来源卵母细胞的来源略，见略，见IVFIVF一章一章22、、供核细胞的准备供核细胞的准备„„细胞培养细胞培养„„细胞周期的调控细胞周期的调控„„a.G0/G1a.G0/G1期期„„b.G2/Mb.G2/M期期培养的成纤维细胞流式细胞仪测定细胞周期33、核移植、核移植--卵母细胞去核卵母细胞去核„„a.a.经验法，有称盲吸法经验法，有称盲吸法„„b.b.荧光法，即荧光检测法荧光法，即荧光检测法„„c.c.挤压法，透明带切口法挤压法，透明带切口法„„d.d.蔗糖法，蔗糖液显示纺锤体（小鼠）蔗糖法，蔗糖液显示纺锤体（小鼠）„„e.e.吸带法，微分干涉显微镜辅助吸带法，微分干涉显微镜辅助„„f.f.化学去核法，化学去核法，etoposideetoposide&CHX&CHX33、、核移植核移植--移核移核„„直接注射法直接注射法„„融合法融合法„„其他方法其他方法33、核移植、核移植--移核移核44、、融合融合„„电融合电融合„„仙台病毒融合仙台病毒融合„„化学融合化学融合55、卵母细胞活化、卵母细胞活化aa化学活化化学活化乙醇、离子霉素乙醇、离子霉素A231876A231876--DMAPDMAPSrClSrCl22bb电活化电活化55、卵母细胞活化、卵母细胞活化————孤雌生殖孤雌生殖„„概念概念孤雌生殖（孤雌生殖（ParthenogenesisParthenogenesis）是指卵子不经受精过程，）是指卵子不经受精过程，直接产生个体的繁殖方式；直接产生个体的繁殖方式；在无脊椎动物和低等脊椎动物中较常见；鸟类也偶尔出在无脊椎动物和低等脊椎动物中较常见；鸟类也偶尔出现，哺乳动物无自然孤雌生殖个体；现，哺乳动物无自然孤雌生殖个体；19991999，，BoedionoBoediono，，88--cellcell孤雌胚胎和孤雌胚胎和88--cellIVFcellIVF胚胎嵌合胚胎嵌合发育到期，出生牛犊；发育到期，出生牛犊；20042004，，KonoKono，通过重构卵母细胞获得只有卵母细胞遗传来，通过重构卵母细胞获得只有卵母细胞遗传来源的小鼠；源的小鼠；UniparentalembryoscouldnotdevelopbeyondD10Constructoocytescontaininggenomesfromnon-growingandfull-grownoocytesH19andIgf2competitionmodelJournalofCellularBiochemistry2003,88:400-407MouseparthenogeneticembryoswithmonoallelicH19expressioncandeveloptoD17.5ofgestationDevelopmentalBiology2002,243:294-300BirthofparthenogeneticmicethatcandeveloptoadulthoodNatureGene