荧光定量PCR实验设计及结果分析

实时荧光定量PCR实验的设计及结果的分析基因有限公司王争强对照组对照组对照组对照组：：：：用作对照的样本，与实验组进行比较实验组实验组实验组实验组：：：：未知样本，用于研究目的基因目的基因目的基因目的基因(GOI)：用于研究的基因内参基因内参基因内参基因内参基因(看家基因看家基因看家基因看家基因)：：：：基因表达量比较恒定的基因，用于校正起始上样量的区别参比样本参比样本参比样本参比样本(Calibrator):用于比较的样本，如未处理样本、正常组织、0时相样本等标准品标准品标准品标准品(Standards)：：：：梯度稀释的已知浓度的样品，测定未知样品的浓度和反应效率Ct值值值值：：：：样品扩增产物的荧光信号达到所设定的荧光阈值时需要的循环数反应效率反应效率反应效率反应效率(E)：：：：PCR扩增的速率术语术语术语术语RT-qPCR流程示意图样本的准备样本的准备样本的准备样本的准备•速度(RNA降解)•RNA酶抑制剂•保存条件分离试剂的选择分离试剂的选择分离试剂的选择分离试剂的选择•液态或组织•植物、动物或者微生物RNA质控质控质控质控•RNA的完整性•RNA的纯度•RNA的浓度•抑制因子的影响RNA提取提取提取提取逆转录引物逆转录引物逆转录引物逆转录引物•随机六核苷酸引物(总RNA)或者OligodT引物(mRNA)•扩增产物在5’端时，尽量避免用OligodT做引物逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶•较高的逆转温度可以减少cDNA二级结构的形成(Freemanetal.1996).逆转录效率逆转录效率逆转录效率逆转录效率•理论上RNA/mRNA逆转录成cDNA的效率是100%(70%)•单链结合染料Oligreen®可以用于测定cDNA的浓度逆转录逆转录逆转录逆转录实时扩增实时扩增实时扩增实时扩增插入式染料插入式染料插入式染料插入式染料•成本低•适用于所有的双链•研究基因较多时适用•特异性低双标记水解探针双标记水解探针双标记水解探针双标记水解探针（（（（TaqMan探针探针探针探针））））•特异性高•目的基因浓度低时结果可靠•需要设计探针及反应条件优化•目的基因较少时适用•成本较高荧光物质的选择荧光物质的选择荧光物质的选择荧光物质的选择实时检测实时检测实时检测实时检测:SYBR®GreenI5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitation实时检测实时检测实时检测实时检测:SYBR®GreenIRQ5’3’5’3’5’3’5’3’激发RQQRQR激发实时检测:双标记探针免费的基于网络的设计软件免费的基于网络的设计软件免费的基于网络的设计软件免费的基于网络的设计软件Primer3（（（（））））•引物和双标记水解探针的设计•Tm的计算MFold（（（（））））•引物和扩怎产物二级结构的预测•二级结构的稳定性(deltaG)和融解温度(Tm)BLAST•结构特异性引物和探针的设计引物和探针的设计引物和探针的设计引物和探针的设计•引物与探针的距离10碱基•避免二级结构•GC含量:45–55%•探针Tm高于引物10oC左右(70oC)•5’端保证不是G•探针少于30个碱基•3’端最后5个碱基不要超过2C或2G•3’端添加磷酸基团•BLAST保证探针特异性探针设计原则探针设计原则探针设计原则探针设计原则扩增产物扩增产物扩增产物扩增产物•产物越短，反应效率越高•理想状态为75–150bp•避免形成稳定的颈环二级结构•避开回文序列•避开G/C含量较高的序列引物引物引物引物•避免二级结构(发卡)•避免出现4个连续相同的碱基(尤其是G)•尽量避免二聚体•长度18–25nt•Tm值:60oC•GC含量:45–55%•保证引物特异性•引物不含有内含子序列引物的设计引物的设计引物的设计引物的设计
SYBR®GreenI浓度浓度浓度浓度•不同稀释倍数进行实验•较高浓度抑制PCR反应•较低浓度导致信号较低引物浓度引物浓度引物浓度引物浓度•上下游引物浓度:300nM•固定DNA模板浓度进行优化•阳性对照和阴性对照•最优的引物浓度:Ct值较小、信噪比较高•融解曲线分析扩增产物特异性•电泳分析确定扩增产物的长度MgCl2浓度浓度浓度浓度•Mg2+•最优的MgCl2浓度:1.5–3.5mM反应优化反应优化反应优化反应优化(掺入式染料掺入式染料掺入式染料掺入式染料)引物和探针浓度引物和探针浓度引物和探针浓度引物和探针浓度•引物浓度25–900nM•探针浓度10–250nM•引物:探针=3:1•最优的引物浓度:Ct值较小、信噪比较高•电泳分析确定扩增产物的长度反应优化反应优化反应优化反应优化(双标记水解探针双标记水解探针双标记水解探针双标记水解探针)4.5μM1.5μM水229.5μl10x缓冲液85μlMgCl251μldNTP68μlTaq8.5μlDNA34μl10μl6.25μMprobe10μl3.75μMprobeadd10μl1.25μMprobe取15μl加入下列PCR反应管中上游引物上游引物上游引物上游引物4.5μM1.5μM0.25μM4.5μM1.5μM0.25μM4.5μM1.5μM0.25μM取140μl预混液加入下列反应管中+5μl+5μl0.25μM下游引物下游引物下游引物下游引物定量分析定量分析定量分析定量分析定量方法的选择定量方法的选择定量方法的选择定量方法的选择绝对定量绝对定量绝对定量绝对定量相对定量相对定量相对定量相对定量-双标曲线双标曲线双标曲线双标曲线-ΔΔCT-AssumptionFreeAnalysis(LinReg)-RelativeExpressionSoftwareTool(REST)基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析综述:AbsoluteQuantificationofmRNAusingrealtimereversetranscriptionpolymerasechainreactionassays.SABustinJ.Mol.Endo200025,169-193标准曲线可通过已知浓度的cDNA/RNA来构建注意事项注意事项注意事项注意事项::::-DNA/RNA纯度-精确移液-标准品的稳定性-避免DNA作为RNA的标准品绝对定量绝对定量绝对定量绝对定量TwoStandardCurvesConcentrationnormalisation(ratio)=meanG.O.I/meanRef.Relativevalue=RatioSample/RatioCalibratorSoftwaresteps•无需标准曲线•测定相对表达量•GOI和REF反应效率相同或者相似（需验证）•假定反应效率100%.ΔΔCT或或或或比较比较比较比较CT分析分析分析分析Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2^[-deltadeltaC(T)]Method.LivakKJ&SchmittgenTD.Methods2001Dec;25(4):402-408总结总结总结总结•减少样品与反应间的差异减少样品与反应间的差异减少样品与反应间的差异减少样品与反应间的差异•选择合适的方法并优化选择合适的方法并优化选择合适的方法并优化选择合适的方法并优化•分析数据分析数据分析数据分析数据