中国甜樱桃病毒病及其检测技术研究进展

中国甜樱桃病毒病及其检测技术研究进展摘要：综述了近年来中国对甜樱桃（ｐｒｕｎｕｓａｖｉｕｍｌ．）病毒病及其检测技术的相关报道，介绍了中国甜樱桃上常见病毒的种类、危害及特性，主要包括：李属坏死环斑病毒（ｐｎｒｓｖ）、李矮缩病毒（ｐｄｖ）、苹果褪绿叶斑病毒（ａｃｌｓｖ）、樱桃锉叶病毒（ｃｒｌｖ）、樱桃病毒ａ（ｃｖａ）、樱桃绿环斑驳病毒（ｃｇｒｍｖ）、樱桃小果病毒（ｌｃｈｖ）；阐述了甜樱桃病毒检测中所用的方法、技术，包括指示植物法（生物学鉴定法）、电子显微镜技术、血清学方法、分子生物学技术方法等。关键词：甜樱桃（ｐｒｕｎｕｓａｖｉｕｍｌ．）；病毒；特性；检测技术ａｂｓｔｒａｃｔ：tｈｅｒｅｃｅｎｔｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｓｗｅｅｔｃｈｅｒｒｙｉｎcｈｉｎａwasreviewed，ｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆｔｈｅｍａｉｎｓｗｅｅｔｃｈｅｒｒｙｖｉｒｕｓｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｎｄｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｓｅｖｉｒｕｓｅｓwereintroduced．ｔｈｅｓｅｖｉｒｕｓｅｓｉｎｃｌｕｄｅｄｐｒｕｎｕｓｎｅｃｒｏｔｉｃｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ，ｐｒｕｎｕｓｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ，ａｐｐｌｅｃｈｌｏｒｏｔｉｃｌｅａｆｓｐｏｔｖｉｒｕｓ，ｃｈｅｒｒｙrａｓｐlｅａｆvｉｒｕｓ，ｃｈｅｒｒｙｖｉｒｕｓａ，ｃｈｅｒｒｙｇｒｅｅｎｒｉｎｇｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ，ｌｉｔｔｌｅｃｈｅｒｒｙｖｉｒｕｓ．ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｗｅｒｅａｌｓｏｄｅｓｃｒｉｂｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｉｎｄｉｃａｔｏｒｐｌａｎｔ，ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｗｅｅｔｃｈｅｒｒｙ（ｐｒｕｎｕｓａｖｉｕｍｌ．）；ｖｉｒｕｓ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ甜樱桃（ｐｒｕｎｕｓａｖｉｕｍｌ．）又名大樱桃，属蔷薇科李属樱亚属植物，原产于欧洲黑海沿岸和亚洲西部［１］，于２０世纪９０年代初引入中国，因其经济效益高、管理简单，成为中国近年来果树产业结构调整的重要树种。２００７年中国甜樱桃栽培面积约９．７万ｈｍ２，产量４０万ｔ左右，主要集中在环渤海湾的辽宁、山东一带［２］。甜樱桃果实酸甜可口，且营养丰富，还有很高的医用价值，被誉为“果中珍品”［３］。近年来随着无性繁殖代数的越来越多，病毒病逐渐成为影响甜樱桃产量和质量的关键因素［１］。据国外报道，目前核果类病毒中樱属病毒主要有６８种，其中可以侵染甜樱桃的病毒约有３４种，比较常见的甜樱桃病毒主要有２０种［１］。中国自开展甜樱桃病毒病的研究以来，已经先后检测并报道了７种病毒，分别是李属坏死环斑病毒（ｐｎｒｓｖ）［４，５］、李矮缩病毒（ｐｄｖ）［６］、苹果褪绿叶斑病毒（ａｃｌｓｖ）［６］、樱桃锉叶病毒（ｃｒｌｖ）［７］、樱桃病毒ａ（ｃｖａ）［８］、樱桃绿环斑驳病毒（ｃｇｒｍｖ）［９］、樱桃小果病毒－２（ｌｃｈｖ－２）［１０］。目前已初步明确了中国甜樱桃主产区病毒病的种类、危害，并在病毒检测方面取得了一定的进展，本研究结合自己的研究成果，综述了中国甜樱桃病毒病及其检测技术的研究进展，期望为今后甜樱桃病毒病的研究提供参考。１甜樱桃主要病毒、危害及特性１．１李属坏死环斑病毒（ｐｒｕｎｕｓｎｅｃｒｏｔｉｃｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ，ｐｎｒｓｖ）ｐｎｒｓｖ是１９３２年由ｖａｌｌｅａｕ［１１］在李和桃树上首次发现的，它可以引起环斑病害，随后在世界范围内广泛传播。该病毒主要侵染欧洲甜樱桃、酸樱桃（ｐ．ｃｅｒａｓｕｓ）、桃（ｐ．ｐｅｒｓｉａ）、苹果（ｍａｌｕｓｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、杏（ｐ．ａｒｍｅｎｉａｃａ）和洋李（ｐ．ｄｏｍｉｓｔｉｃａ）等李属和蔷薇属植物［１２］，寄主多达１８０多种植物。ｐｎｒｓｖ是分布最广、经济上危害最严重的李属病毒。常见的危害症状包括坏死环斑、碎叶、带状叶、粗花叶，有时还会产生耳突，病叶出现坏死斑，中间部分坏死、脱落形成穿孔。该病毒主要通过种子、花粉、线虫等传播，也可以通过机械调运进行远距离传播［１］。ｐｎｒｓｖ对大樱桃危害严重，各国对其非常重视，１９９２年中国将其列为入境检疫危险性有害生物［１３］。ｐｎｒｓｖ属于雀麦花叶病毒科（ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ），等轴不稳环斑病毒属（ｉｌａｒｖｉｒｕｓ）成员。病毒粒体球形，直径约为２３ｎｍ，线形正义ｓｓｒｎａ分子，三分体基因组（ｒｎａ１、ｒｎａ２、ｒｎａ３）。其中，ｒｎａ１和ｒｎａ２为单顺反子，分别编码病毒的复制酶蛋白ｐ１和ｐ２，ｒｎａ３为双顺反子，编码病毒的运动蛋白（ｍｐ或者ｏｒｆ３ａ），亚基因组ｒｎａ４参与病毒的外壳蛋白（ｃｐ或者ｏｒｆ３ｂ）的表达。２００１年ｔｅｒｌｉｚｚｉ等［１４］又发现ｐｎｒｓｖ病毒粒子里还包含有ｒｎａ５。根据血清学反应，将ｐｎｒｓｖ分为３种血清型，即ｃｈ３、ｃｈ９、ｃｈ３０［１５］和2种致病型ｍ和ｒ［１１］（温和致病型和皱缩花叶病型）。按照分子生物学及其序列同源性分析，ｐｎｒｓｖ又可分为组ｉ（ｐｖ３２）、组ⅱ（ｐｖ９６）和组ⅲ（ｐｅ５）［１３－１５］３组，其中，皱缩花叶病型株系分在组ｉ；温和致病型株系分在组ⅱ；组ｉｉｉ中的株系既有温和致病型的株系也有引起严重症状的类型［１６］。１９９６年ｚｈｏｕ等［４］利用血清学试剂盒在中国首次报道了ｐｎｒｓｖ的发生；同年李青等［５］利用ｅｌｉｓａ法对北京地区的桃、樱桃上ｐｎｒｓｖ的发生情况进行了检测；１９９８年阮小凤等［６］对甜樱桃上ｐｎｒｓｖ等病毒感染情况进行ｅｌｉｓａ检测，ｐｎｒｓｖ感染率为２１．４％。２０００年侯义龙［１７］率先在国内建立起李属植物ｐｎｒｓｖ及ｐｄｖ的ｒｔ－ｐｃｒ分子检测体系；代红艳等［１８］完成了甜樱桃茎尖组培苗中ｐｎｒｓｖ的ｒｔ－ｐｃｒ检测。２００５年李明福等［１９］在北京甜樱桃上发现了ｐｎｒｓｖ。２０１１年本课题组在借鉴前人的基础上，开发了新的ｐｎｒｓｖ的ｒｔ－ｐｃｒ检测方法，并对山东地区甜樱桃常见病毒的发生情况进行调查检测［１３］，其中ｐｎｒｓｖ感染率为３８％（此结果未发表）。１．２李矮缩病毒（ｐｒｕｎｕｓｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ，ｐｄｖ）１９３６年由ｔｈｏｍａｓ［２０］首次报道，分布在欧洲、美洲、日本、澳大利亚和新西兰等李属果树种植区。主要侵染欧洲甜樱桃、洋李、桃、圆叶樱桃（ｐ．ｍａｈａｌｅｂ）、樱花（ｐ．ｓｅｒｒｕｌａｔａ）、梨（ｐｙｒｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ）等植物。ｐｄｖ可引起樱桃黄花叶病、樱桃褪绿环斑病，与ｐｎｒｓｖ侵染植物的症状相似，叶片细长畸形、产生褪绿坏死环斑、黄化花叶等症状。ｐｄｖ与ｐｎｒｓｖ２种病毒常常造成复合侵染，从而造成更严重的危害。ｐｄｖ主要通过嫁接、种子、花粉传播［１］。ｐｄｖ为雀麦花叶病毒科等轴不稳环斑病毒属成员。球状病毒粒子，直径约为２２ｎｍ［２１］。基因组有３条正义ｓｓｒｎａ，ｒｎａ１和ｒｎａ２编码病毒转录和复制的蛋白，ｒｎａ３编码ｍｐ和ｃｐ蛋白，ｃｐ蛋白由ｒｎａ４表达，ｒｎａ４和ｒｎａ３一起被包裹。ｐｄｖ在全世界普遍发生，为中国入境检疫危险性有害生物。在国内，１９９６年李青等［５］首次报道甜樱桃感染有ｐｄｖ。２０００年侯义龙［１７］应用ｒｔ－ｐｃｒ方法在国内建立起ｐｄｖ的分子生物学检测体系，２００５年在北京、大连地区的桃、樱桃及樱桃组培苗中检测到ｐｎｒｓｖ、ｐｄｖ［２２，２３］。２００９年赵世恒等［２４］再次从北京怀柔地区检测到ｐｄｖ。２０１１年宗晓娟等［２５］建立了新的ｐｄｖ的ｒｔ－ｐｃｒ检测方法，在山东地区甜樱桃果园中检测到甜樱桃的ｐｄｖ感病植株。１．３苹果褪绿叶斑病毒（ａｐｐｌｅｃｈｌｏｒｏｔｉｃｌｅａｆｓｐｏｔｖｉｒｕｓ，ａｃｌｓｖ）在中国ａｃｌｓｖ发生普遍，对苹果、甜樱桃等造成严重影响，感染病毒后会使其生长量减少１６％～３６％，产量降低１６％～６０％，极大地危害果品产量和质量。ａｃｌｓｖ可以单独感染，也可以与其他病毒复合感染果树，引起果树衰退病，苗木及嫁接的根、新梢、叶、花、果均表现出症状。例如，ａｃｌｓｖ可以和ｐｎｒｓｖ协同侵染，会造成樱桃坏死线纹病，染病叶片上出现呈带状的褪绿斑最终坏死。ａｃｌｓｖ可以经机械传播、嫁接传播或通过无性繁殖材料传播，也可通过种子传播［１］。ａｃｌｓｖ为纤毛病毒属（ｔｒｉｃｈｏｖｉｒｕｓ）重要成员之一，其病毒粒体呈弯曲的线状，病毒粒子为螺旋对称结构，长约７２０ｎｍ，直径约１２ｎｍ，病毒为线形正义ｓｓｒｎａ，长约７５５５ｎｔ。单分体基因组ｒｎａ含有３个部分重叠的开放读码框（ｏｒｆｓ），最大的ｏｒｆ编码复制酶（２１６．５ｋｄａ），其余２个可能编码移动蛋白（５０．４ｋｄａ）和外壳蛋白（２１．４ｋｄａ）［２６，２７］。洪霓等［２８］利用苹果分离株制备的ａｃｌｓｖ抗血清对田间果树样品进行检测，结果成功检测出桃树和梨树上的ａｃｌｓｖ。早期阮小凤等［６］利用ｅｌｉｓａ法对陕西甜樱桃病毒病发生情况进行调查，发现ｐｎｒｓｖ、ｐｄｖ、ａｃｌｓｖ发生率较高，李春敏等［２９］对昌黎甜樱桃上的苹果褪绿叶斑病毒进行ｐａｓ－ｅｌｉｓａ检测，１４株甜樱桃树上苹果褪绿叶斑病毒感染率为４７．１％。２０００年侯义龙［１７］建立了包括ａｃｌｓｖ在内的主要果树病毒的ｒｔ－ｐｃｒ检测体系，并对其进行了系统研究。１．４樱桃锉叶病毒（ｃｈｅｒｒｙrａｓｐlｅａｆvｉｒｕｓ，ｃｒｌｖ）ｂｏｄｉｎｅ等［３０］首次在野生樱桃上发现该病毒。樱桃锉叶病的症状是多样性的，正常叶的叶面为左右对称，叶片呈椭圆形，病叶表现明显的叶缘皱缩，严重的缺刻现象，形状变得极不规则。在田间条件下，侵染还会诱发其他症状，包括：小叶、节间断缩、失绿黄化、叶脉白化、果实小、叶片背面突起等。对中国樱桃实生砧的５年生甜樱桃的衰弱症状检查发现，枝条韧皮部和形成层发生褐变，短枝很快枯死，大枝逐步死亡，最后整株枯死［７］。ｃｒｌｖ自然寄主有欧洲甜樱桃、圆叶樱桃和苹果等，观赏性樱花可作为锉叶病毒的中间寄主，在甜樱桃栽培区不宜种植。主要通过线虫传播（ｘｉｐｈｉｎｅｍａａｍｅｒｉｃａｎａ），也可经嫁接、花粉、昆虫和螨类传播，包括叶螨、叶蝉等［３１，３２］。ｃｒｌｖ属于豇豆花叶病毒科线虫多面体病毒属（ｃｏｍｖｉｒｉｄａｅnｅｐｏｖｒｉｕｓ）。病毒粒子二十面体，呈等轴对称结构，直径约３０ｎｍ。二分体基因组，ｒｎａ１长６９９２ｎｔ，ｒｎａ２长３２７４ｎｔ［３２］。２００２年谭海东等［７］通过电镜观察和紫外分光光度计的检测方法，首次报道了樱桃锉叶病在中国的发生情况，并提纯到该病毒。１．５樱桃病毒ａ（ｃｈｅｒｒｙｖｉｒｕｓａ，ｃｖａ）ｃｖａ是１９９５年由ｊｅｌｋｍａｎｎ［３３］在克隆ｌｃｈｖ的ｃｄｎａ时意外发现的，会与ｌｃｈｖ复合发生，但并不影响ｌｃｈv的症状的表达［３４］。ｃｖａ最初仅在英国发生，后来陆续传播到德国、加拿大和波兰等地［３５］。ｃｖａ主要侵染欧洲甜樱桃、酸樱桃和杏等李属植物。ｃｖａ作为一种典型的潜隐性病毒，寄主无明显症状，可通过嫁接传播。ｃｖａ属于发形病毒属（ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ），病毒呈弯曲线状，长６４０～７００ｎｍ。基因组ｒｎａ含有２个开放性阅读框（ｏｒｆｓ），其中ｏｒｆ１编码包含着复制酶蛋白的多聚蛋白，约为２６６ｋｄａ。ｏｒｆ２可能编码病毒的运动蛋白，约为５２ｋｄａ［１］。２００９年在云南昆明的甜樱桃样品上检测发现到ｃｖａ［８］，这是该病毒在中国甜樱桃上的首次报道。２０１０年在北京等地的甜樱桃果树上也发现ｃｖａ的存在［３６］，发生较为普遍。２０１１年本课题组在山东地区病毒病的调查中，发现ｃｖａ感染率约为６０％（此结果未发表）。１．６樱桃小果病毒（ｌｉｔｔｌｅｃｈｅｒｒｙｖｉｒｕｓ，ｌｃｈｖ）樱桃小果病严重危害欧洲甜樱桃和酸樱桃，发生普遍，最初发现于加拿大英属哥伦比亚东部［３７］，在欧洲大部分地区和北美均有相关病例报道。２００４年波兰首次报道发现了ｌｃｈｖ－１［３５］。ｌｃｈｖ引起樱桃小果病症状复杂多变，表现程度常依季节、地区和果园的不同有很大的差异。典型症状有叶片边缘