NGS基础培训

NGS文库相关注意事项4样本建库的判定基准123文库出库的标准文库定量混库和Pooling注意核酸样本优良的区分A230：碳水化合物在230nm具有最高吸收峰的吸收波长；A260：核酸在260nm具有最高吸收峰的吸收波长；A280：蛋白质在280nm波长处有最高吸收峰；A230，A260,A280纯DNA或者RNA：A260/A230=2.52.5仪器带来的误差；2.5样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品（2.0）。纯DNA：A260/A280=1.8纯RNA：A260/A280=2.0DNA1.8有蛋白质污染（1.6）；RNA2.0有蛋白污染（1.8），2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。RIN(RNAIntegrityNumber)RNA的降解则表现为核糖体RNA带的弥散，以Agilent2100进行毛细管电泳并以软件的RIN(RNAIntegrityNumber)分数评估，10为RNA完整性最好，0为最差。原核生物：5S、16S及23S，5S含有120个核苷酸，16S含有1540个核苷酸，而23S含有2900个核苷酸；真核生物：5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。S为沉降系数（sedimentationcoefficient），当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。样本-DNA问题样本的常见特征1.降解；2.污染；3.粘稠；问题样本的常见特征-降解基因组DNA轻微降解基因组DNA中度降解基因组DNA严重降解问题样本的常见特征-污染基因组DNA胶孔污染基因组RNA污染严重降解中度降解轻微降解M11标1标2RNA样本的常见问题-降解、污染基因组污染样本-RNA样本异常-颜色轻微颜色异常中度颜色异常深度颜色异常真核mRNA样本建库标准参考真核LncRNA样本建库标准参考真核miRNA样本建库标准参考真核DNA样本建库标准参考真核外显子样本建库标准参考-基因组真核外显子样本建库标准参考-单细胞真核外显子样本建库标准参考-特殊样本测序策略对片段的限制范围测序策略最适片段范围(加接头120bp)风险片段范围(加接头120bp)PE150320bp－520bp300bp－600bp文库判定-定性出库浓度：总量20ng，浓度2ng/ulqPCRMix准备qPCR标准品制备文库稀释液的准备8连排及qPCR管的准备数据处理实验前的准备工作样品倍乘稀释Mix分装qPCR反应液的准备并混匀上机操作作用：定量检测文库的有效浓度；工作原理：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程；合格标准：一般在求在2-30nM之间，微生物建库要求在4-30nM之间。文库判定-定量qPCR文库判定-定量文库稀释液稀释100倍稀释100倍稀释10000X检查库检表，并准备文库检查试剂和芯片是否够用，并平衡到室温检查仪器设备是否可用实验前的准备工作清洗电极检查压胶器，压胶加marker、ladder，样品上机操作清洗电极并进行数据处理作用：定性检测文库的片段长度；工作原理：基于微流控芯片实验技术；合格标准：插入片段偏差在20%以下，主峰明显、无杂峰，无接头和无引物二聚体。文库判定-定性2100文库判定-上机POoling统一稀释至3nM/ul按文库每条Lane产出算比例Pooling坚持扩大稀释比例原则