LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册

1Leica激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司2013年3月2目录：1系统的组成系统组成……………………………………….………..………3光路示意图………………………………………….…….……42系统的使用2.1开机顺序…………………..…………….…….…………52.2软件界面简介…………..…………….………..………72.3在显微镜下观察样品.…………….……….….……82.4采集共聚焦图像………..…………….………….…..92.5XYZ三维扫描（Z-Stack）………………………..…112.6时间序列扫描（TimeseriesorxytScan）…152.7波长扫描（xyλScan）…………………………..162.8HyD检测器……..………………..………………...…….172.9图像的保存及输出………..…………….…….…….182.10关机………..…………….…………………………..……203系统的维护..…………….…………………………….……213LeicaSP8系统组成图41可见波长激光或白激光15UVIS,HIVIS或VISIR的光路镀膜2声光调制器（AOTF）16扫描视场旋转镜（Abbe-Konig旋转）*3红外激光（IR）*17在NND位置上的反射光检测器（RLD）*4电光调制器18物镜（可提供各种选择）*5紫外激光*19在NND位置上的透射光检测器（TLD）*6AOTF或直接调制器（DMOD）20正方型针孔7STED激光*21Fluorifier盘*8Setlight监控二极管22X1出口接口*9AOBS,及其他选配件23外置检测器*10用于FRAP的光束增强镜*24色散棱镜11红外激光耦合25分开的荧光光谱12与CS2紫外光路耦合的紫外激光26最多5个光电倍增管或4个HyD检测器13STED激光耦合*选配组件14全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件52系统的使用2.1开机顺序（硬件标号请参考前面的系统组成图）（1）因为FSU和CSU硬件的电源控制）不同，请分别按照如下步骤开机：FSU系统CSU系统依次打开“PCMicroscope”、“ScannerPower”、“LaserPower”三个按钮，将“LaserEmission”上的激光开关钥匙旋至“On-1注意：显微镜控制器的开关一般是常开的，在打开“PCMicroscope”按钮后指示灯应该点亮，如果不亮，请打开其开关。先按电脑主机上的电源按钮启动电脑，再打开显微镜控制器的开关，然后依次打开“ScannerPower”、“LaserPower”两个按钮，将“LaserEmission”上的激光开关钥匙旋至“On-1之后两个系统的操作一样（2）打开荧光激发光源（按绿色的Power按钮，如右图）光源亮度调节旋钮光闸Power按钮6（3）电脑进入操作系统界面后，双击电脑桌面“LASAF”图标启动共聚焦操作软件。（4）进入配置选择界面后，在“Configuration”下拉菜单中选择需要的配置；（其中带有“simulator”字样的为模拟方式，该方式不控制显微镜硬件，不能拍摄图像，适合处理数据）“Microscope”菜单中选择显微镜型号；（图中“Resonant”选项为快扫功能，可按需要打开或关闭，只有配备了快扫功能的系统才会显示该选项），点击“OK”，系统继续启动。（5）在“InitializeStage”提示界面选择是否初始化载物台（如果选择“No”，则Tilescan、Mark&Find和Matrix功能不能使用）。注意：如果配置的是手动载物台，则不会跳出该提示界面。（6）系统自检完后，进入LASAF操作界面，点击界面最上方“Configuration”按钮进入配置界面→点击左边“LaserConfig”按钮→打开所需激光（OFF→ON），Argon激光还需拖动右方滑块以调节激光输出功率72.2软件界面简介功能界面切换：参数设定（Configration）、扫描取图（Acquire）、图像处理（Process）、定量测量（Quantify）工具和文件管理界面切换：Experiments界面下显示当前拍摄和打开的图片，Acquisition下显示的是当前功能界面的功能按钮和参数拍摄参数：包括图像像素Format、扫描速度speed、图像放大Zoomfactor、视野旋转Rotation等。三维扫描工具组，用于设定和显示三维扫描的Z轴范围，及其他辅助设定光路显示及设置区域，从上向下直观显示了从激发到荧光检测的光路细节和关键设置图像显示窗口预设光路选择按钮激光控制栏分光镜选择按钮物镜选择按钮预览按钮，可用于开始和停止预览拍摄图像按钮叠加图像显示按钮，在使用两个或以上数量通道拍摄多色图像时，用于显示所有通道叠加后的图像界面缩放调节滑块，左右拖动可以调节界面项目的显示比例界面调整栏，左右拖动可调整光路设置区域与图形显示窗口的范围82.3在显微镜下观察样品2.3.1选择物镜：可通过显微镜主机右侧的物镜转换按钮，或软件中的“Objectives”按钮进行选择（如下图）。（在显微镜设置软件LeicaAFHardwareConfigurator中可设定最下方的红圈中的按钮为干/油镜转换，在干/油镜之间切换时需要先按一下此按钮才能完成转换）2.3.2明场观察：将样品置于载物台上，按显微镜左侧的TL/IL按钮打开明场光路（如右图）（因显微镜所处状态不同，有时候需要按两次才能打开），在明场条件下选择合适的视野。通过调焦按钮或旋钮调节至合适的z轴平面，通过显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。如果是电动载物台，需通过遥控手轮调节载物台的运动以选择合适的视野（如下图）。2.3.3按显微镜前面板的荧光滤块选择按钮切换至荧光观察光路（如右图所示），其上的标注与荧光颜色的对应关系为：I3-绿色，N2.1--红色，A—蓝色，有些配置的显微镜按钮对应的荧光颜色可能会有所不同，请以实际情况为准。再按荧光光闸按钮（SHUTTER）打开荧光，进行样品的荧光观察。2.3.4观察完毕后，按显微镜前面板上的9“SHUTTER”按钮以保护样品2.4采集共聚焦图像2.4.1光路设置：调用已有的设置：选择“Load/Savesinglesetting”下拉菜单中已有的设置，激光波长及其输出功率、分光镜、检测波长范围、检测器gain及offset都会自动设置，包含几种最常用的荧光染料。选择某一设置后，可按样品的实际情况对参数进行优化（如后述），并以新的名称保存。（如右图）修改已有设置：可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选PMT、调节PMT检测范围、调节PMT的gain或offset等。如下图。建立新的设置：也可从零开始建立新的设置。选择所需激光及其功率、适宜的分光镜、检测器及检测波长范围。10分光镜选择原则：根据所用激光波长来选择合适的分光镜。○1405激光选择Substrate；○2其他可见波长的激光根据其波长选择分光镜，如488激光可选择DD488/552、TD488/552/638分光镜。○3RT15/85分光镜所有波长激光都可用，但是会损失85%的激光能量和15%的荧光能量，一般在当现有分光镜无法满足当前激光谱线组合或进行光谱扫描的时候选用。SequentialScan:若染料的发射光谱有重叠，为减少串色，成像时每种染料要单独激发，或者说，每次只用一种激发光激发，并只检测一种染料。可用SequentialScan来实现。（如右图）激活SequentialScan功能，可在下面的Seq中分别设置各个染料的激发和检测光路。2.4.2选择扫描模式默认模式为xyz扫描，是最常用的扫描模式，可用于xy扫描和z轴层切（xyz扫描）。还可在下拉菜单中选择由x，y，z，t（时间）以及λ（波长）组合而成的多维扫描模式，如xzy，xyt，xyλ，xyzt，xyzλ，xyzλt等。2.4.3设置扫描参数包括分辨率（format）、扫描速度（speed）、针孔大小（pinhole）、线平均（lineaverage）、面平均（frameaverage）、累加（accumulation）及放大倍数（Zoom）等。（如右图）分辨率：默认值为512×512。也可选择更低或更高分辨率。分辨率越高，所获取的图像文件越大，采图所需时间也越长。扫描速度：默认值为400Hz。活细胞或运动的样品成像可能需要更快的速度。可选择双向扫描（BidirectionalX）来达到更高速度，这时可能需要进行相位校准（Phasecorrection）。针孔大小：默认值为1AU。如果增大针孔直径，可增加信号强度，但是所获取图像的共聚焦效果会降低，光切厚度也会随之增加。平均：用于降低背景噪音。分为线平均（Lineaverage）和面平均（Frameaverage），可在下拉菜单中选择平均的次数。11累加：仅用于荧光非常弱的样品2.4.4预览图像点击软件Acquire界面左下方的“Live”按钮以预览图像（下图），图像将显示在右侧的显示屏上。预览开始后，“Live”按钮变为“Stop”，点击“Stop”按钮可停止预览。注意：一旦预览开始，激光开始照射样品，为减少对样品的伤害，应快速操作，尽量减少预览的时间。建议：点击Live按钮之前，可调节format至512×512，speed至600Hz以获得较快的刷新频率。预览应达到以下目的：○1找到最适合观察的焦平面；○2使图像亮度动态范围达到最佳。可通过调节控制面板的“ZPosition”旋钮找到最适合观察的焦平面（如下图）；或者调节遥控手轮或显微镜镜体上的调焦旋钮（见第8页图）。图像亮度动态范围可通过调节激光输出功率（见第9页图）、SmartGain和SmartOffset（见上图）。参数的调整原则：（1）SmartGain的调节：增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均减小。一般情况下，Gain值的正常范围为500—1000；（2）SmartOffset的调节：可扣除背景噪音，但标本信号也有一定程度的扣除。原则上，在保证图像质量的前提下，DigitalOffset值越接近于0越好；（3）另外，对于每个通道，需要灵活调节激光的强度：激光强度越高，则信号越强，同时标本更容易被漂白或淬灭。当PMTgain值高于800或HyDgain值大于100%时荧光图片亮度还是不够时，可以考虑适当增加激光强度。在做活细胞或者光切时，应尽量减少激光强度，原则上，在保证图像质量的前提下，激光强度越低越好。12图像亮度动态范围的判断方法：理想的荧光图像中应该只有少数像素点达到饱和，可通过位于图像左侧的LUT按钮进行观察。。LUT按钮（下图红圈）可在LUT（即指定的荧光颜色，也称伪彩）、“GlowOverUnder（GlowOU）”和灰度图三档之间切换。在GlowOU模式中，灰度值达到饱和的像素点显示为蓝色，而灰度值为0的像素点显示为绿色。调节SmartGain使图像中仅少数像素点呈蓝色，调节SmartOffset来降低图像的背景。荧光图像SmartOffset的默认值为0%，通常应将其调为负值以使图像背景呈绿色。下图中B图亮度及背景值设置均未达最优化值，调节SmartGain和SmartOffset后，达到C图中的效果，部分信号呈蓝色，而背景呈绿色。对于HyD检测器，其背景噪声很低，无需通过调节SmartGain来降低背景。对透射光图像，同样可以调节透射光PMT的电压和偏移值来进行优化，有时可将SmartOffset调至高于0%以增加对比度。如果启用了SequentialScan，在应该在每个扫描序列（Seq）分别通过预览来调整图像亮度。2.4.5采集图像对于单通道染色，或多通道染色同时扫描，单击“CaptureImage”按钮采集图像。对于序列扫描，或多维图像扫描，单击”Start”按钮进行图像采集。（见下图）在此之前可改变扫描分辨率、线/面平均次数等扫描参数。扫描分辨率的设置原则：通常情况下，采集图像时，为充分利用物镜的分辨能力，可直接点击“O