RNA干扰技术原理及应用

RNAi的发现1995年，GuoS等试图阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的par-1基因的表达。设计：反义RNA特异性地阻断par-1基因的表达；正义RNA以期观察到基因表达的增强。结果:二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。RNAi的提出直到1998年2月，FireA和MelloC才首次揭开这个悬疑之谜。他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。他们证实，GuoS博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNAinterference，简称RNAi）。RNAi广泛存在于自然界随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。1、RNAi机制体外实验结果的提示体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢？由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。RNAi作用的简单模型当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。RNAi研究的一般技术路线2、siRNA的设计何为siRNAs越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（smallinterferingRNAs，siRNAs）来抑制特定的哺乳动物基因表达。siRNA即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子。如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题，不同的实验室有不同的结果。一般设计原则（1）从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议不要针对5'和3'端的非编码区（untranslatedregions，UTRs）。这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。（2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。负对照一个完整的siRNA实验应该有负对照。作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。3、制备siRNAs的方法（1）化学合成尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究；不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素（2）体外转录相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是能够更快的得到siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。Figure.UseofChemicallySynthesizedandinVitroTranscribedsiRNAstargetingß-ActintoInduceGeneSilencing.（3）用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。这种方法——制备一份混合有各种siRNAs“混合鸡尾酒”就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在体外消化，得到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。（3）用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNAdsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAseIII比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响(1-4)。最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗Ku-70levelswerereduced86%incellstransfectedwiththesiRNAcocktail,comparedtonon-transfectedcontrols.（4）siRNA表达载体多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III启动子(polIII)中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。包括的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNApolIII启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。使用这类载体，需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的polIII启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有效的时候。（4）siRNA表达载体毫无疑问，siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）Followingtransfection,thecellswereselectedwithhygromycin.Threeweeksfollowingselection,thecellswereanalyzedforGFPexpressionbyfluorescencemicroscopy.Green:GFP.Blue:DAPIstainednuclei.GFPlevelswereremarkablyreduced(94%)incellstransfectedwiththeGFPsiRNA-encodingpSilencer2.1-U6hygrosiRNAExpressionVectorascomparedtothosetransfectedwithanemptysiRNAexpressionvector.HeLacellsexpressingcycle3GFPweretransfectedwithpSilencer2.1-U6hygrocontaininganinsertencodingansiRNAtargetingcycle3GFPorpSilencer2.1-U6hygrowithoutansiRNA-encodinginsert.（5）siRNA表达框架siRNA表达框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto采用，包括一个RNApolIII启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNApolIII终止位点。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配！（5）siRNA表达框架如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子；不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）。72hourspost-transfection,thecellswereassessedusingnuclearstainingwithDAPIandimmunofluorescenceusingac-FOSantibody.Non-transfectedcells(NT)aswellascellstransfectedwithanSECexpressinganegativecontrolsiRNA(scramble)demonstratewild-typelevelsofc-FOS.Therelativelevelofreductioningeneexp