第八章-蛋白质分选与膜泡运输(第4版)

第八章蛋白质分选与膜泡运输(ProteinSortingandVesicularTransport)第一节细胞内蛋白质的分选蛋白质分选(proteinsorting)或蛋白质寻靶（proteintargeting)依靠蛋白质自身信号序列，从蛋白质起始合成部位转运到其功能发挥部位的过程。蛋白质分选不仅保证了蛋白质的正确定位，也保证了蛋白质的生物学活性。一、信号假说(signalhypothesis)与蛋白质分选信号GunterBlobel等提出关于分泌蛋白到内质网膜上进行合成的假说,认为蛋白合成的位置是由其N端氨基酸序列决定的,该假说具有普遍性。1999年，Blobel因此获得诺贝尔生理学或医学奖。信号假说的主要内容①分泌蛋白在N端有一信号序列，它指导刚开始合成的多肽和核糖体到ER膜上。②蛋白质转运与翻译过程同时进行。多肽边合成边通过ER膜上的通道进入ER腔。信号序列在分泌蛋白质转运中的作用蛋白水解酶水解实验无细胞体外翻译系统(含有RER小泡)加入蛋白水解酶,不加入去垢剂，不能使新生肽水解。但同时加入去垢剂,蛋白质水解。提示新生肽链是边合成边运输的。基因重组实验编码黑猩猩的α-球蛋白(在游离核糖体上合成并存在于胞质溶胶中的可溶性蛋白)的基因接上一段编码E.coli分泌蛋白β-半乳糖透性酶(β-lactamase)的信号序列DNA,将该基因加入到无细胞的转录和翻译体系(含狗组织中分离的ER膜)中,杂合蛋白出现在哪个部位？指导分泌性蛋白质在rER合成的决定因素包括1、蛋白质N端的信号肽(signalpeptide）2、信号识别颗粒（signalrecognitionparticle，SRP）3、信号识别颗粒的受体（停泊蛋白，dockingprotein，DP）信号肽（signalpeptide)引导新合成肽链转移到内质网上的一段多肽，位于新合成肽链的N端；长16-26个氨基酸，完成分选过程后，经信号肽酶切除。无严格的专一性。由于信号肽又是引导肽链进入内质网腔的一段序列，又称开始转移序列（starttransfersequence）(p139)。信号肽的作用①通过与SRP的识别和结合,引导核糖体与内质网膜结合;②通过信号序列的疏水性,引导新生肽跨膜转运。信号识别颗粒（signalrecognitionparticle，SRP）由6条不同多肽和一个小RNA分子构成的RNP颗粒。识别并结合从核糖体中合成出来的内质网信号序列，指导新生多肽及核糖体和mRNA附着到内质网膜上。信号肽/核糖体-SRP-SRP受体SRP受体（SPRreceptor，停泊蛋白）膜整合蛋白，为异二聚体蛋白，存在于内质网膜上，其α亚基可与SRP的p54亚基以及GTP特异结合，增强SRP/新生肽/核糖体与SRP受体结合的强度。在游离核糖体上起始合成SRP结合信号肽后暂停翻译SRP与rER上的DP结合信号肽与移位子结合，打开孔道SRP脱离，肽链合成重启信号肽被切除、降解肽链合成终止，核糖体释放，肽链折叠（四）分泌性蛋白质的共翻译转运过程(p139)内在停止转移锚定序列（internalstop-transferanchorsequence，STA）内在信号锚定序列（internalsignal-anchorsequence，SA）(p139)肽链上的一段特殊AA序列，与内质网膜的亲合力很高，能阻止肽链继续进入内质网腔，使其成为跨膜蛋白质。（五）跨膜蛋白的共翻译转运机理（1）单次跨膜蛋白a.内在停止转移锚定序列（STA）其信号肽在N端，有一个STA，一旦停止转移序列进入移位子，并与其位点相互作用，移位子钝化，停止转移过程。信号肽释放，STA留在膜中成为单次的α螺旋跨膜片段，N端在膜的腔内侧，C端在基质侧。停止转移序列与单次跨膜蛋白的形成STAb.内在信号锚定序列（SA）•SA既是开始转移序列，又作为停止转移序列，保留在脂双层中成为单次跨膜的α螺旋。•SA前后所带电荷决定其插入的方向。具有较多正电荷氨基酸的一端朝向细胞质基质。胞质侧(2)多次跨膜蛋白多肽链中含有多个开始转移序列和停止转移序列，这些疏水序列成对起作用。蛋白质转运的两种方式•共翻译转运（co-translationaltranslocation)分泌蛋白在信号肽引导下边翻译边跨膜转运的过程(p139)。•后翻译转运（post-translationaltranslocation）蛋白质在细胞质基质合成以后在导肽的指导下转运到线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的过程（p140）。二、蛋白质分选转运的基本途径与类型（一）核基因编码的蛋白质分选途径（p141）后翻译转运途径–在游离核糖体上合成–靶区：线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、细胞核、细胞基质的驻留蛋白或骨架蛋白、内质网（某些分泌蛋白）共翻译转运途径–在游离核糖上起始合成–SRP引导转运到rER–边合成，边转运–靶区：细胞质膜及细胞内膜系统真核细胞蛋白质分选的主要途径和类型NLS导肽（二）四种基本转运类型（p141）1蛋白质的跨膜转运(transmembranetransport)进入内质网腔（膜）、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体等2膜泡运输(vesiculartransport)内质网高尔基体细胞表面、质膜、溶酶体3选择性的门控转运(gatedtransport)进入细胞核（核孔复合体）4细胞质基质中蛋白质的转运三、蛋白质向线粒体的分选(p142)核基因编码的线粒体蛋白的合成和输入大体上要涉及到4个步骤：•在细胞质基质中合成多肽前体物•前体物和细胞器表面的受体结合•穿过并移进细胞器膜•前体物被加工成成熟多肽含有较为丰富的带正电荷的碱性氨基酸(特别是精氨酸)，穿插在不带电荷的氨基酸序列之间，对牵引蛋白质跨膜具有重要作用基本不含带负电荷的酸性氨基酸序列中羟基氨基酸(尤其是丝氨酸)的含量较高整个前导序列可形成既具亲水性又具疏水性的两性-螺旋凭藉外正内负的膜电位，使前导肽及其所牵引的蛋白质得以顺利过膜线粒体前导序列的特点：线粒体蛋白质特有的导肽序列(a)导肽的线性序列；(b)导肽折叠后的氨基酸残基的分布图输入蛋白在输入之前，首先要与伴侣蛋白Hsc70结合，而去折叠。线粒体外膜中有输入受体蛋白(如TOM20和TOM22)，可识别基质定位序列，并与之结合，将前体蛋白送入外膜通道(由TOM40构成)。线粒体基质蛋白的输入定位于基质中的蛋白质还要再通过内膜通道(由TIM23和TIM17)进入基质，在此部位外膜和内膜紧贴在一起。transloconoftheoutermembrane,TOMtransloconoftheinnermembrane,TIMimportreceptor定位序列在基质中被蛋白酶切除。在内膜转移通道处有基质Hsc70陪伴蛋白，该蛋白与TIM44接触水解ATP，驱动基质前体蛋白转运到基质中。多肽链在伴侣蛋白作用下折叠和装配成三维和四维结构。TOM20/22线粒体内、外膜接触部位电镜图靶向线粒体基质的跨膜运送靶向线粒体膜间隙的跨膜运送途径A是主要的注意与内膜蛋白途径A不同点①一次性穿膜蛋白②二次穿膜蛋白③多次穿膜蛋白线粒体内膜蛋白的输入①一次性穿膜蛋白如细胞色素氧化酶的CoxVa亚基，其前体蛋白的N末端含有基质定位序列，此序列可被TOM20/22输入受体识别，通过外膜的通用输入孔和内膜的TIM23/17转移复合物输入到基质中。输入过程中，基质定位序列被切除。CoxVa含有一个疏水性停止转移序列(stop-transfersequence)，当蛋白质穿过TIM23/17通道时，停止转移序列阻止C-端穿过内膜，然后肽链转移到脂双层中。②二次穿膜蛋白肽链含有基质定位序列和2段内部疏水区(Oxl1定位序列)，肽链进入基质后，基质定位区被切除。Oxl1疏水区被内膜中的Oxa1蛋白所识别，并将蛋白质插入脂双层中。③多次穿膜蛋白这类蛋白质N末端没有基质定位序列，而肽链内部含有多个定位序列。如ADP/ATP对向转运体(antiporter)，此蛋白含有6个穿膜区为定位序列，外膜中的TOM70可识别内部定位序列。通过外膜的通用运输孔穿过外膜，在膜间隙中的TIM9/10的协助下，蛋白质被移送到内膜中的转移复合体(由TIM22/54组成)，负责将输入蛋白的疏水性定位序列移入内膜脂双层中。靶向线粒体内膜的跨膜运送TOM:transloconoftheoutermembraneTim:transloconoftheinnermembrane外膜蛋白质的输入停止转移信号为N-端基质定位序列之后一段疏水性氨基酸片段可阻止蛋白质进入基质，同时使蛋白质结合到外膜此途径中，蛋白质输入后，其基质定位序列和内部疏水性序列均不切除。4、膜间隙蛋白质的输入①主要途径②穿外膜直接途径②穿外膜直接途径输入蛋白质通过外膜的TOM40通用输入孔，直接将蛋白质释放到膜间隙中，不涉及到内膜，与内膜转移因子无关。例如细胞色素c血红素裂合酶(负责血红素与细胞色素c共价结合)，是一种线粒体膜间隙蛋白。①主要途径前体物肽链中含有两个不同的N末端定位序列。例如细胞色素b2，进入基质后，N末端第一个序列被基质中的蛋白酶切除。第二个序列阻止肽链完全穿过内膜，前体物变成内膜TIM23/17通道中的中间物。中间物侧向扩散，离开TIM23/17通道。内膜中的蛋白酶切除穿膜的疏水性片段，将成熟的蛋白质以可溶性形式释放到膜间隙中。线粒体输入蛋白定位序列的排列形式大多数线粒体蛋白含有N末端基质定位序列，但各种蛋白质的不相同。核基因编码的线粒体蛋白不都是通过前述途径转运的有的线粒体外膜蛋白无前导序列，不以前体形式运送插入细胞色素c可能是直接扩散通过外膜而进入线粒体，再在细胞色素c-血红素裂合酶催化下，加上血红素后成为成熟型并定位于内膜外侧。注意！•膜泡运输是蛋白分选的一种特有方式•膜泡运输还形成了细胞内复杂的膜流(membraneflow)•转运膜泡出芽发生在特定区域：蛋白信号与受体结合部位•转运泡在细胞内沿微管或微丝运输：膜泡运输有关的马达蛋白有3类（详见细胞骨架章节）–动力蛋白（dynein）：趋向微管负端–驱动蛋白（kinesin）：趋向微管正端–肌球蛋白（myosin）：趋向微丝的正极第二节细胞内膜泡运输非膜泡运输一、包被膜泡类型•已知三类：网格蛋白(clathrin)/接头蛋白包被膜泡COPI(coatproteinI)包被膜泡COPII(coatproteinII)包被膜泡三种包被膜泡的功能包被类型GTP酶组成与衔接蛋白运输方向clathrin无ARFClathrin重链与轻链，AP2质膜→内体Clathrin重链与轻链，AP1高尔基体反面→内体Clathrin重链与轻链，AP3高尔基体→溶酶体COPIARFCOPαββ’γδεζ高尔基体顺面→内质网晚期高尔基扁平囊→早期COPIISar1Sec23/Sec24复合体，Sec13/31复合体，Sec16内质网→高尔基体顺面（一）网格蛋白包被膜泡•运输途径：质膜→内体；高尔基体TGN→内体；高尔基体TGN→溶酶体、植物液泡。•网格结构：3重链、3轻链，形如triskelion，clathrin的曲臂交织在一起，形成5边形网孔的笼子•衔接蛋白：连接包被与受体。ClathrincoatedvesiclesSelectivetransportbyclathrincoatedvesicles•当衣被小泡形成时，可溶性蛋白dynamin聚集成一圈围绕在芽的柄部，使柄部的膜尽可能地拉近（小于1.5nm），导致膜融合，pinchoff衣被小泡。（二）COPI包被膜泡•功能：介导膜泡逆向运输。回收、转运内质网逃逸蛋白（escapedproteins）返回内质网；也可介导高尔基体不同区域间的蛋白质运输。•组成：由7种蛋白和ARF组成。•回收信号：Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）。COPIVesiclesCopIandIIVesiclesLys-Asp-Glu-Leu（KDEL）（三）COPⅡ衣被小泡•介导内质网到高尔基体的物质运输。